Izolacja kolonii komórek rakowych z kurczaka CAM: procedura izolowania komórek rakowych z kultur jaj bez skorupek

Streszczenie

Źródło: Stoletov, K. et al. Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony chorioalantoicznej pisklęcia przyżyciowego. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy izolację przerzutowych kolonii komórek rakowych z błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) kurczaka przy użyciu hodowli jaj bez skorupy. Ta metoda pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem czynników, które mogą być odpowiedzialne za przerzuty raka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja kolonii przerzutowych

1. W 5 dniu po wstrzyknięciu należy wyjąć zarodki z inkubatora i sprawdzić CAM zarodków pod kątem rozmieszczenia kolonii z przerzutami. Zidentyfikuj zarodki o równomiernym rozmieszczeniu kolonii, w których obecne są zwarte (lub nadmiernie inwazyjne) kolonie.
   nuta: Proces hodowli zarodków kurzych nie jest sterylny, dlatego wszystkie etapy badań przesiewowych muszą być wykonywane w bardzo czystych warunkach, aby uniknąć przyszłego zanieczyszczenia kultur tkankowych. Zakażenie jest dość rzadkie i można go łatwo uniknąć, nosząc rękawiczki i maskę oraz używając tylko sterylnych narzędzi podczas procedur wstrzykiwania komórek i izolacji kolonii. Zaleca się badanie zarodków jeden po drugim, aby zmniejszyć ich narażenie na temperaturę otoczenia w laboratorium i zapobiec zakażeniu.
2. Zlokalizuj interesującą Cię kolonię przerzutową. Zwartą kolonię można opisać jako taką, w której większość komórek rakowych znajduje się na ograniczonym obszarze w tkance CAM (komórki wydają się "zlepione razem"). Kolonię inwazyjną można opisać jako kolonię, w której komórki rakowe "rozpraszają się" w tkance CAM (ryc. 1A, B).
   UWAGA: "Zwartość" kolonii przerzutowej można wytłumaczyć albo hamowaniem inwazji komórek rakowych, hamowaniem proliferacji komórek rakowych, albo jednym i drugim. Należy zwrócić uwagę na wszystkie scenariusze, a kolonie kontaktowe powinny być odizolowane (Rysunek 1A, B). Prosty fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy może być używany do rozróżniania zwartych i inwazyjnych fenotypów kolonii przerzutowych.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie pociągnij tkankę CAM, która zawiera interesującą kolonię przerzutową, w górę za pomocą cienkich kleszczy (ryc. 1C).
4. Odetnij tkankę CAM, która zawiera kolonię przerzutów, za pomocą nożyczek chirurgicznych.
5. Przenieść tkankę CAM, która zawiera kolonię przerzutów, do pustej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml (na lodzie) i zamknąć pokrywę probówki.
   nuta: Izolowane kolonie mogą być trzymane na lodzie do 3 godzin bez utraty żywotności.
6. Powtarzaj procedurę wycinania, aż wszystkie interesujące kolonie zostaną zebrane do oddzielnych probówek. Aby uniknąć cierpienia zwierząt, nie wycinaj więcej niż 2-3 kolonie z jednego zarodka. Eutanazja zarodków poprzez zamrożenie w temperaturze -20 °C (lub inna zatwierdzona metoda) natychmiast po wycięciu kolonii.
7. Delikatnie zmielić tkankę CAM w probówce mikrowirówkowej za pomocą sterylnej igły 18G. Użyj osobnej igły dla każdej kolonii.
8. Dodać 100 μl 1x roztworu kolagenazy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
9. Odwiruj komórki i tkankę CAM w odległości 300 x g przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
10. Odessać roztwór kolagenazy i ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach używanych dla interesującej linii komórkowej.
    nuta: Zwykle tkanka CAM nie jest całkowicie zdysocjowana po leczeniu kolagenazą, a komórki rakowe najpierw namnażają się w kawałkach tkanki CAM, a dopiero później migrują na naczynie do hodowli tkankowej.
11. Ponownie wirować komórki i tkankę CAM przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
12. Zawiesić komórki i fragmenty tkanek CAM w 1 ml kompletnej pożywki wraz ze współczynnikiem selekcyjnym (jeśli występuje), a następnie przenieść do pojedynczego 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych.
    nuta: Fibroblasty CAM kurczaka mogą utrzymywać się w hodowli tkankowej przez wiele pasaży, hamując ekspansję klonalną. Zdolność do rozszerzania kolonii przerzutowych w obecności czynnika selekcyjnego (tj. jeśli wektor, który został użyty do wytworzenia fluorescencyjnego komórek rakowych, koduje również gen oporności na antybiotyki u ssaków) może znacznie przyspieszyć ekspansję klonalną. Przed badaniem przesiewowym należy przeprowadzić eksperyment z krzywą zabijania, aby upewnić się, że stosowane jest odpowiednie stężenie antybiotyków.
13. Przez następne 1-3 tygodnie codziennie monitoruj komórki rakowe pod kątem wzrostu i zanieczyszczenia.
14. Gdy komórki osiągną 70–80% zlewności, przenieś je do naczynia hodowlanego o większej objętości.
    nuta: Zaleca się namnażanie komórek do momentu, aż co najmniej dwie fiolki kriogeniczne każdego klonu będą mogły zostać zamrożone. Utrzymanie dużych ilości hodowli tkankowej może być pracochłonne i niepotrzebne.
15. Przejdź do sekwencjonowania lub następnej rundy selekcji, gdy tylko zostanie osiągnięta wystarczająca liczba komórek rakowych. Ogólnie rzecz biorąc, 1 x 10⁶ komórek rakowych jest wystarczająca dla nowoczesnych technik sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
16. Przejdź do ponownego wstrzyknięcia klonu oraz obrazowania i ilościowego określenia zwartości kolonii lub kontaktu komórki rakowej z naczyniem krwionośnym (ryc. 2A). Alternatywnie przejdź do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub powtórz wybór kolonii.
    UWAGA: Aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich, zalecane są co najmniej dwie rundy selekcji. Z powodzeniem zastosowano dwa podejścia. 1) Rozwiń każdy klon i wstrzyknij ponownie indywidualnie, aby potwierdzić fenotyp kolonii. 2) Wymieszaj wszystkie rozszerzone klony w stosunku 1:1 każdy, wstrzyknij ponownie jako mieszaninę i powtórz cykl selekcji.

Wyniki

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki dla różnych etapów protokołu badań przesiewowych.(A) Kolonie przerzutowe utworzone przez heterogeniczne (transdukowane biblioteką komórki linii komórek rakowych HEp3), 5 dni po wstrzyknięciu. Czerwona strzałka pokazuje zwartą kolonię (potencjalne dodatnie trafienie), którą należy wyciąć. (B) Kolonie przerzutowe utworzone...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml.	Corning	CLS430791-500EA
18 gauge x 1 1/2 BD precyzyjny igła	Bd	BD305196	Używamy 1,2 mm x 40 mm, jest to możliwe Aby użyć krótszych igieł, jeśli jest to preferowane
Wirówka stołowa.	Dostępnych jest wiele źródeł		Dowolna wirówka kompatybilna z TC, która może być używany do obracania komórek to stosowny
Kolagenaza	Sigma	Silnik C0130-100MG
waciki bawełniane	Dostępnych jest wiele źródeł		musi być wysterylizowany przed użyciem
Pożywki odpowiednie dla komórki Używane linie	Dostępnych jest wiele źródeł		Uprawiamy HT1080, HEp3 i b16 cell linie w DMEM, 10% nośniki FBS
Inkubator do jaj	Dostępnych jest wiele źródeł		Dokładny model, który jest niezbędny zależy od skali ekranu. Dostępne źródła to MGF Company Inc., Savannah, Georgia lub Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, Kalifornia
Probówki eppendor, 1,5 ml	Sigma	Silnik T4816-250EA
Zapłodnione jaja White Leghorn	dowolny lokalny dostawca
cienkie kleszcze	Dostępnych jest wiele źródeł		musi być wysterylizowany przed użyciem
Oprogramowanie do analizy obrazu			Używamy Nikon Elements
PBS (1x)	Dostępnych jest wiele źródeł
Plastikowe naczynia do ważenia	Import	CA11006-614	Wymiary to 78x78x25mm; wiele Dostępne są inne źródła
małe nożyczki chirurgiczne	Dostępnych jest wiele źródeł		musi być wysterylizowany przed użyciem
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny			Używamy Zeiss Lumar v12