Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wstrzykiwanie komórek myszom
- Przygotować mieszaninę komórek w stosunku 1:1 do macierzy błony podstawnej (po 50 μl każda).
- Najpierw dodaj komórki, a następnie stopniowo pipetuj matrycę błony podstawnej. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Należy upewnić się, że mieszanina została przygotowana bezpośrednio przed wstrzyknięciem dla zwierzęcia. Dodawanie komórek do macierzy błony podstawnej przez dłuższy czas może spowodować osadzanie się komórek w mieszaninie macierzy, co utrudnia energiczne wstrząsanie mieszaniną. Spowoduje to znaczną zmienność wielkości guza między myszami.
- Delikatnie wymieszaj. Upewnij się, że wszystkie kroki związane z matrycą są wykonywane na lodzie. Matryca błony podstawnej ulegnie polimeryzacji w temperaturze pokojowej.
- Przygotować strzykawki do inokulacji.
- Załaduj 0,5 ml strzykawek insulinowych (23G) 100 μl roztworu macierzy komórkowej/błony podstawnej.
- Trzymaj strzykawki na lodzie, aby uniknąć polimeryzacji macierzy błony podstawnej.
- Znieczulenie myszy należy umieścić w komorze z izofluranem i tlenem (2,5%).
- Upewnij się, że myszy są głęboko znieczulone przed wykonaniem wstrzyknięcia (zapewniając brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi).
- Wbić igłę w prawą lub lewą okolicę policzkową. Odbywa się to przez dostępną otwartą przestrzeń po obu stronach ust.
- Upewnij się, że język myszy nie przeszkadza.
UWAGA: Łatwo jest szturchnąć język, co spowoduje guzy języka. W razie potrzeby przesuń język na przeciwną stronę.
- Trzymaj strzykawkę równolegle do okolicy policzkowej, znajdując się w jamie ustnej.
- Gdy strzykawka jest gotowa do wstrzyknięcia, należy ją odciągnąć i powoli włożyć ją pod kątem 10°.
- Wstrzyknąć 100 μl zawiesiny macierzy komórki/błony podstawnej przez okres 5 sekund.
- Przytrzymaj strzykawkę na miejscu przez dodatkowe 5 sekund, aby upewnić się, że cały materiał został wstrzyknięty.
UWAGA: W przypadku myszy kontrolnych niebędących nosicielami nowotworu, wstrzyknij mieszaninę pożywki i matrycy bez surowicy (jak opisano powyżej) bez komórek nowotworowych.
- Delikatnie wyjąć strzykawkę.
- Kontynuuj powyższą procedurę z pozostałymi myszami.
- Odczekaj 1 tydzień, aż guzy zaczną pojawiać się rażąco (50-200 mm3 dla komórek B4B8 i LY2).
