Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Inokulacja komórek bocznych i leczenie antagomiR donowotworowe
- Przygotowanie komórek
- Inżynieria linii komórkowej ludzkiego raka tarczycy Cal62 (mutacje KRASG12R i p53A161D) w celu nadekspresji transgenicznego konstruktu, który konstytutywnie wyraża GFP i lucyferazy (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selekcjonować komórki transgeniczne na podstawie oporności na antybiotyki lub sortowania komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.
- Hoduj komórki w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej penicyliną, streptomycyną i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zawiesić 1 x 106 komórek w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.
- Inokulacja komórek w bokach myszy
- Wymieszaj komórki z taką samą ilością macierzy błony podstawnej. Na przykład dodać 1 x 106 komórek w 50 μl PBS do 50 μl matrycy błony podstawnej (patrz tabela materiałów) i delikatnie wymieszać.
- Wstrzyknąć 100 μl próbki (komórki w PBS + matryca błony podstawnej) podskórnie w lewy bok 6-tygodniowych myszy z niedoborem odporności BALB/c nu/nu za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
- Leczenie antagomii wewnątrznowotworowej
- Zawiesić antagomiR (patrz tabela materiałów) lub kontrolę ujemną w 500 μl wody destylowanej wolnej od RNaz.
- Przed wstrzyknięciem należy przygotować 2 nmol antagomiR lub próbki kontrolnej wraz z odczynnikiem do dostarczania in vivo (patrz tabela materiałów) do każdego wstrzyknięcia.
- Najpierw wymieszać roztwór antagomiR (patrz tabela materiałów) i bufor kompleksujący (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1. Na przykład dodać 80 μl roztworu inhibitora miRNA (16 nmol) do 80 μl buforu kompleksującego (zawartego w zestawie odczynników do dostarczania in vivo, patrz tabela materiałów).
- Doprowadź odczynnik do dostarczania in vivo do temperatury pokojowej. Dodać 160 μl do probówki o pojemności 1,5 ml i natychmiast dodać 160 μl rozcieńczonego roztworu antagomiR. Przywrócić pozostały odczynnik do temperatury -20 °C. W razie potrzeby odczynnik należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia po rozmrożeniu.
- Natychmiast (10 s) przeprowadzić wirowanie, aby zapewnić kompleksowanie odczynnika do dostarczania in vivo-antagomiR.
- Inkubować mieszaninę odczynnika do dostarczania in vivo i antagomiR przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Krótko odwirować probówkę w celu odzyskania próbki.
- Rozcieńczyć kompleks 6-krotnie, dodając 1360 μl PBS o pH 7,4 i dobrze wymieszać.
- Kontynuować podawanie in vivo kompleksu odczynnik-antagomiR (8 myszy/stan) lub przechowywać kompleks w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia przed wstrzyknięciem. Wstrzyknąć domięśniowo 200 μl domięśniowo do każdego guza (2 nmol antagomiR).
UWAGA: Objętość i ilość antagomiR jest niezależna od objętości guza.
- Zabieg wykonuj 3 razy w tygodniu (poniedziałek, środa i piątek) przez 2 tygodnie.
- Analiza wzrostu guza
- Wstrzyknąć 50 μl roztworu 40 mg/ml substratu D-lucyferyny (patrz tabela materiałów) podskórnie w każdym punkcie czasowym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
- Po 8 minutach od wstrzyknięcia znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z tlenem. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i dostosuj podanie znieczulenia zgodnie z potrzebami, aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.
- Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
- Zobrazuj sygnał bioluminescencyjny za pomocą oprogramowania do obrazowania in vivo (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Suwmiarki mogą być również używane do pomiaru objętości guza i wzrostu guza.
- Po uzyskaniu sygnałów bioluminescencyjnych przeanalizuj wzrost guza, porównując oba zabiegi i określ znaczenie za pomocą testu t. Aby przeanalizować wariancję wewnątrz grupy, należy użyć SEM.
