Ortotopowa inokulacja komórek raka tarczycy do mysiej tarczycy: procedura ustalania ortotopowego modelu myszy raka tarczycy

Streszczenie

Źródło: Julia Ramirez-Moya, et al. in vivo Hamowanie mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film opisuje procedurę ortotopowej inokulacji komórek raka tarczycy do tarczycy mysich modeli, które mogą następnie służyć jako cenna platforma do oceny kancerogenezy i odkrywania potencjalnych strategii leczenia.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Ortotopowa inokulacja komórek tarczycy

1. Przygotowanie komórek
   1. Zaprojektuj linię komórkową ludzkiego raka tarczycy Cal62 w celu nadekspresji transgenicznego konstruktu, który konstytutywnie wyraża GFP i lucyferazy. Selekcjonować komórki transgeniczne na podstawie oporności na antybiotyki lub sortowania komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.
   2. Hoduj te komórki w DMEM uzupełnionym antybiotykami (penicyliną i streptomycyną) i 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   3. Zawiesić 1 x 10⁵ komórek w 5 μl PBS.
2. Inokulacja komórek do tarczycy myszy
   1. Wstrzyknąć 100 μl leku przeciwbólowego (buprenorfina) i 100 μl antybiotyku (cefalosporyna) podskórnie 7-tygodniowym myszom BALB/c nu/nu. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
   2. Wstrzyknąć 5 μl roztworu komórkowego do tarczycy myszy.
      1. Znieczulij mysz za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z tlenem i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym w sterylnej komorze przepływowej. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i dostosuj podawanie środka znieczulającego zgodnie z potrzebami, aby utrzymać płaszczyznę operacji.
      2. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
      3. Dla każdej myszy zdezynfekuj szyję jodopowidonem i wykonaj nożyczkami nacięcie około 2 cm w skórze. Po otwarciu odsłoń szyję, przesuwając gruczoły ślinowe.
      4. Wypreparuj mięśnie paska za pomocą kleszczy preparacyjnych i/lub nożyczek, aby odsłonić tchawicę i tarczycę. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 μl wstrzyknąć 5 μl roztworu komórkowego do prawego zrazika tarczycy, znajdującego się z boku chrząstki sercowatej.
      5. Zmień położenie gruczołów ślinowych i zszyj nacięcie jedwabiem za pomocą plecionych, powlekanych, niewchłanialnych szwów.
      6. Dodaj jodopowidon do obszaru rany i umieść mysz na kocu termicznym, podczas gdy wraca do zdrowia po znieczuleniu.
   3. Następnego dnia po operacji wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy (buprenorfina) i dodać 3 ml płynnego ibuprofenu (40 mg/ml) do 250 ml wody do picia przez 1 tydzień.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matryca membrany podstawnej: Matrigel Basement Membrane Matrix o wysokim stężeniu	Corning	#354248
Odczynnik do dostarczania in vivo: Odczynnik Invivofectamine 3.0	Rybak termiczny	IVF3005
Oprogramowanie do obrazowania in vivo: IVIS-Lumina II Imaging System	Suwmiarka Nauki przyrodnicze