Przygotowanie zawiesiny ECM: technika uzyskiwania jednorodnej zawiesiny z tkankowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Streszczenie

Źródło: Kornmuller, A. et al. Produkcja pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako platform hodowli i dostarczania komórek specyficznych dla tkanki. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje przygotowanie homogenizowanej i strawionej zawiesiny macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek zdecelulizowanych i liofilizowanych. Technika ta pomaga w wytwarzaniu porowatych pianek i mikronośników pochodzących z ECM do wykorzystania jako substraty w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D.

Protokół

1. Przetwarzanie tkanek bezkomórkowych

1. Decelularyzacja i liofilizacja
   1. Decelularyzacja tkanek będących przedmiotem zainteresowania zgodnie z ustalonym protokołem.
      nuta: Rusztowania w niniejszym badaniu zostały przygotowane zgodnie z opublikowanymi protokołami decelularyzacji dla ludzkiej bezkomórkowej tkanki tłuszczowej (DAT), pozbawionej komórek tkanki skórnej świń (DDT) i pozbawionej komórek lewej komory świń (DLV). Dostępny na rynku, nierozpuszczalny kolagen może być również używany do wytwarzania pianek i mikronośników, takich jak kolagen pozyskiwany ze ścięgien bydlęcych, który jest z powodzeniem stosowany w zakresie stężeń 10-50 mg / ml. Inne nierozpuszczalne źródła kolagenu mogą być wykorzystywane, ale mogą wymagać optymalizacji w celu zidentyfikowania zakresu stężeń, który zapewni stabilne rusztowania.
   2. Przenieś uwodnioną tkankę pozbawioną komórek lub oczyszczony kolagen do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z kleszczami i dodaj wystarczającą ilość podwójnie destylowanej wody (ddH₂O), aby zanurzyć tkankę, do maksymalnej całkowitej objętości 35 ml.
   3. Zamrażać próbkę przez noc w temperaturze -80 °C, z probówką wirówkową ustawioną poziomo podczas zamrażania, aby zmaksymalizować powierzchnię do sublimacji podczas późniejszej liofilizacji.
   4. Zdjąć nakrętkę z probówki wirówkowej i przenieść zamrożoną próbkę do słoika do liofilizacji.
   5. Liofilizować próbkę za pomocą liofilizatora laboratoryjnego przez 48–72 godzin lub do całkowitego wyschnięcia.
      nuta: Czas schnięcia może się różnić dla różnych liofilizatorów i tkanek bezkomórkowych.
   6. Drobno zmielić liofilizowany ECM na małe kawałki (~1–2 mm³) za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych.
   7. Przechowywać rozdrobniony ECM w eksykatorze do czasu, gdy będzie gotowy do dalszej obróbki.
      nuta: Zaleca się natychmiastowe użycie rozdrobnionego ECM, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci z otoczenia.
2. Kriomielenie
   1. Napełnij komorę mielenia ze stali nierdzewnej o pojemności 25 ml do laboratoryjnego młyna kulowego mielonym liofilizowanym ECM i dodaj dwie kule mielące ze stali nierdzewnej o średnicy 10 mm.
   2. Zamknij i całkowicie zanurz załadowaną komorę mielenia w ciekłym azocie na 3 minuty.
   3. Mielić zamrożoną próbkę przez 3 minuty przy 30 Hz (1 800 obr./min) na drobny proszek.
      nuta: Liczba powtórzeń tych kroków może się różnić w zależności od źródła ECM. Na przykład DAT zazwyczaj wymaga 3 cykli mielenia, aby wytworzyć drobny proszek.
3. Przygotowanie zawiesiny ECM
   1. Odważyć 250 mg mielonego (w przypadku pianek) lub kriomielonego (w przypadku pianek lub mikronośników) ECM i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Patrz krok 1.1.6 i sekcja 1.2 w celu przygotowania odpowiednio rozdrobnionego ECM i ECM zmielonego w kriomieleniu.
      nuta: Protokół ten ma na celu przygotowanie zawiesiny ECM o stężeniu 50 mg/ml, która jest zalecana dla ludzkich DAT, DDT świńskich i świńskich DLV. W zależności od konkretnego źródła ECM, jednorodne zawiesiny mogą być wytwarzane przy wyższych lub niższych stężeniach początkowych.
   2. Dodać 5 ml buforu 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) do probówki wirówkowej i zaznaczyć poziom cieczy na probówce.
   3. Przygotować roztwór podstawowy α-amylazy, dodając 7,5 mg α-amylazy do 1 ml 0,22 M NaH₂PO₄ (pH 5,4) buforu. Dodać 100 μl roztworu podstawowego α-amylazy (0,75 mg α-amylazy: 0,3% w/w suchej tkanki) do próbki. Dodać 0,22 M NaH₂PO₄, aby uzyskać końcową objętość 10 ml.
   4. Mieszaj zawiesinę w sposób ciągły z prędkością 300 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej.
   5. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, nie naruszając strawionego osadu ECM. Zawiesić granulowany materiał w 10 ml 5% NaCl rozcieńczonego w ddH₂O.
   6. Powtórzyć krok 1.3.5, w sumie dwa płukania z 5% NaCl w_ddH2O.
   7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowany materiał w 10 ml ddH₂O.
   8. Mieszaj zawieszenie w sposób ciągły przy 300 obr./min przez 10 min przy SR.
   9. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, nie naruszając strawionego osadu ECM.
   10. Dodać 0,2 M kwasu octowego do oznaczenia 5 ml wykonanego w kroku 1.3.2.
   11. Zawiesinę mieszać w sposób ciągły przy 120 obr./min O/N w temperaturze 37 °C.
   12. Homogenizować zawiesinę ECM w temperaturze pokojowej w odstępach 10-sekundowych za pomocą ręcznego homogenizatora wyposażonego w sondę piłokształtną o szerokości 10 mm, aż nie pozostaną żadne widoczne fragmenty. Umieścić zawiesinę w zlewce z zimną wodą między przerwami homogenizacji, aby zapobiec przegrzaniu.
       nuta: W zależności od źródła ECM, może być konieczne dalsze rozcieńczenie w 0,2 M kwasie octowym w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny. Nadmierne chłodzenie zawiesiny ECM może spowodować wzrost lepkości, który może zakłócać wydajną homogenizację. Jeżeli zauważy się wzrost lepkości, próbkę można ponownie podgrzać do temperatury 37 °C i poddać dalszej obróbce.
   13. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca przed wyprodukowaniem pianki lub mikronośnika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy, lodowaty	Sklep BioShop	ACE222.5
α-amylaza	Sigma	101074694	od Aspergillus aryzae
Wirówka 75004251	Thermo Scientific		Z wahliwym wirnikiem kubełkowym do probówek wirówkowych o pojemności 15 i 50 ml
Probówki wirówkowe (15 ml)	Sarstedt	Numer katalogowy: 62.554.205
Eksykator	Fisher Naukowy	8624426	Do liofilizowanego ECM i przechowywania na biorusztowaniu
Woda podwójnie destylowana (ddH2O)			Z systemu oczyszczania wody Barnstead GenPure xCAD
ECM (macierz zewnątrzkomórkowa)			Wyizolowany z ludzkiej tkanki tłuszczowej, skóry właściwej świni lub mięśnia sercowego świni, zgodnie z opisem w Flynn i wsp. 2010, Reing i wsp. 2010 oraz Wainwright i wsp. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Homogenizator ręczny	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-359-251	Prędkość obrotowa: 8 000 - 30 000 obr./min
Akcesoria do homogenizatora: sondy generatora z zębami piły	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-261-17	Wymiary: 10 x 95 mm
Ciekły azot
chlorek sodu	Sklep BioShop	7647-14-5
Sodu fosforan jednozasadowy	Sklep BioShop	Numer katalogowy: 10049-21-5
Nożyczki chirurgiczne	Firma VWR	Numer katalogowy: 82027-590

powiedział: