Ekstrakcja rdzenia kręgowego: protokół izolacji mysiego rdzenia kręgowego do badań in vitro

Streszczenie

Źródło: Na'ara, S. et al. Modelowanie in vitro inwazji nowotworowej neuronów: model zwoju korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół izolacji rdzenia kręgowego od modelu mysiego do badań in vitro.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Pobieranie rdzenia kręgowego

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą komory CO₂. Unikaj zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może to spowodować uszkodzenie korzeni zwojowych z powodu sił ścinających. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki w sterylnych warunkach.
2. Namocz zwierzę w 70% etanolu. Ten krok jest ważny dla sterylizacji i zapobiegania przeciąganiu się włosów przez narządy wewnętrzne.
3. Pozostaw mysz do wyschnięcia z etanolu. Zapobiegaj jakiemukolwiek kontaktowi etanolu z narządami wewnętrznymi z powodu neurotoksyczności.
4. Po wysuszeniu myszy ustaw ją za pomocą szpilek w pozycji leżącej (twarzą do dołu). Umieść szpilki na każdej kończynie tylnej i przedniej.
5. Za pomocą kleszczy wykonaj nacięcie w linii środkowej rozciągające się czaszkowo-ogonowo od tylnej szyi do odcinka lędźwiowego kręgosłupa. Następnie podnieś płaty skórne obustronnie za pomocą kleszczy i odsłoń tkankę podskórną.
6. Dotykaj czaszki myszy aż do osiągnięcia połączenia czaszkowo-szyjnego. Za pomocą nożyczek prostopadłych do zwierzęcia przeciąć mięśnie szyjki macicy i kręgosłup na skrzyżowaniu czaszkowo-szyjnym (7.^{kręg szyjny}), używając ciężkich kleszczy. Wypreparuj kręgosłup doogonowo i wytnij kręgosłup ciężkimi kleszczami, aż osiągnie poziom lędźwiowy (poziom kończyn tylnych).
7. Wykonaj pełną transsekcję ogonową na poziomie odcinka lędźwiowego kręgosłupa (5. kręg lędźwiowy) za pomocą ciężkich kleszczy.
8. Najedź myszą (stroną do góry). Nie ma potrzeby zakrywania nacięcia, ponieważ DRG jest ekstrahowany z dolnych poziomów kręgów, a nie z szyjki macicy.
9. Przeciąć w linii środkowej od szyi do brzucha, cofnąć skórę na boki, a następnie przeciąć, aby otworzyć otrzewną.
10. Usuń narządy wewnętrzne wewnątrz otrzewnej (wątroba, śledziona, trzustka, żołądek i jelito) en bloc. Następnie należy usunąć narządy zaotrzewnowe (tj. nerki i trzustkę). Czaszkowo otwórz ścianę klatki piersiowej.
11. Za pomocą kleszczy i ostrza chirurgicznego przetnij żebra, pozostawiając 5 mm żeber obustronnie od kręgosłupa. W tym momencie kręgosłup jest oddzielony od reszty ciała.
12. Dwukrotnie przemyć kręgosłup z krwi zimną (4 °C) świeżą solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F4142
Ostrze chirurgiczne	Sigma-Aldrich	Z309036
nożyczki	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S3271
Szalki Petriego 35 mm, szklane dno	de groot	60-627860
70% etanolu	Sigma
Zimny PBS	Przemysł biologiczny	02-023-1A

powiedział: powiedział: