Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotuj rozwiązania
- Przygotować 1 l roztworu wodorowęglanu Krebsa-Ringera (KRB) zawierającego 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3, 1,2 mM Na2HPO 4,1,2 mM MgCl2, 11,5 mM glukozy i 2,5 mM CaCl2. W dniu użycia roztwór KRB należy utrzymywać na lodzie.
nuta: KRB może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia i powinien być wstępnie bąbelkowany mieszanką 97%O2 i 3% CO2 przez co najmniej 10 minut przed użyciem.
2. Sekcja wibratomu nerki
- Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby delikatnie chwycić i usunąć przygotowaną nerkę z lodowatego roztworu KRB. Natychmiast umieść nerkę na bibułie chłonnej na ~2-4 s, aby usunąć nadmiar wilgoci zewnętrznej. Delikatnie przetoczyć nerkę po bibule chłonnej, aby upewnić się, że wszystkie boki miąższu wyschły, aby zapewnić optymalne przyleganie nerki do etapu wibratomu.
UWAGA: Ponieważ miedniczka nerkowa znajduje się wewnątrz nerki, a zatem jest chroniona przez miąższ zewnętrzny, ten krótki okres wysuszania nie byłby szkodliwy dla integralności tkanek.
- Natychmiast nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego (~1 cm2) na podstawę płytki próbki wibratomu i za pomocą tępo zakończonych kleszczyków umieść nerkę, moczowodem do dołu, na obszarze pokrytym klejem. Delikatnie uciskaj w dół górną część nerki płaską krawędzią kleszczyków przez około 10–20 sekund, aby wysuszyć klej.
nuta: Aby ustabilizować nerkę podczas tej procedury, użyj dodatkowej pary kleszczy, aby utrzymać nerkę w pozycji pionowej podczas wysychania kleju. Bardzo ważne jest, aby nerka przylegała do płytki próbki w pozycji pionowej, tak aby sekcje były cięte prosto. Aby upewnić się, że nerka pomyślnie przylega do płytki próbki, delikatnie popchnij bok nerki. Jeśli nerka pomyślnie przylgnęła do płytki, podstawa nerki powinna pozostać przymocowana do płytki.
- Mocno przymocuj płytkę z próbką do dna tacki buforowej. Dostosuj poziom roztworu KRB tak, aby górna część nerki była całkowicie zanurzona. Podczas etapów cięcia, gdy ostrze wibratomu przesuwa się głębiej w tacę buforową, należy usunąć roztwór KRB, aby uchwyt ostrza nie zanurzył się w roztworze.
nuta: Jeśli klej nie wyschnie całkowicie przed przystąpieniem do tego kroku, klej często przesuwa się w górę od podstawy do miąższu nerki. Ten nadmiar kleju sprawi, że cięcie będzie bardziej zróżnicowane. Jeśli tak się stanie, wyjmij nerkę z płytki i przystąp do świeżego preparatu nerkowego.
- Aby uzyskać automatyczne cięcie wibratomów, wybierz pozycję początkową i końcową cyklu cięcia ostrza wibratomowego. Sprawdź, czy te pozycje znajdują się w odległości ~0,5–1 cm od nerki, aby upewnić się, że przy każdym przesunięciu ostrza cała płaszczyzna nerki jest podzielona na sekcje.
- Przygotuj płytkę wielodołkową (24- lub 48-dołkową), wypełniając studzienki roztworem KRB i umieść płytkę na lodzie.
nuta: Po wygenerowaniu poszczególne sekcje należy umieścić w oddzielnych studzienkach, aby śledzić głębokość sekcji.
- Rozpocznij automatyczny proces cięcia. Podczas początkowego przejścia ostrza upewnij się, że ostrze styka się z samą górną częścią nerki. Jeśli kontakt nie zostanie nawiązany, wyreguluj początkową pozycję Z ostrza.
- Za pomocą kleszczy zbierz odcinki, które są uwolnione z nerki. Natychmiast przenieś skrawki do poszczególnych studzienek i zanotuj głębokość Z sekcji, aby ocenić przybliżoną lokalizację PKJ w obrębie odcinków nerek.
nuta: W zależności od parametrów cięcia, niektóre odcinki mogą nie zostać odcięte od bloku nerkowego. W takim przypadku ostrożnie użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby wyciąć odcinki z bloku nerkowego. Użytkownicy są również zachęcani do aktywnej wizualizacji skrawków pod mikroskopem świetlnym podczas swobodnego unoszenia się w poszczególnych studzienkach, aby zapewnić optymalne ustawienia cięcia i lokalizację tkanki. Sekcje zawierające PKJ zazwyczaj pochodzą z odległości ~ 1000–1500 μm od górnej części nerki.
- Kontynuuj protokół sekcji, aż regiony PKJ staną się bardziej widoczne. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z opisem regionów PKJ w miarę postępu sekcji.
- W tym momencie zoptymalizuj parametry cięcia, aby upewnić się, że skrawki są równomiernie uwolnione z bloku nerkowego i są nienaruszone. Dodatkowo upewnij się, że regiony PKJ są ciągłe i nieprzerwane, ponieważ uszkodzone ściany PKJ nie pozwolą na odpowiednie obrazowanie komórek w ścianie z powodu zapadnięcia się. Jeśli ścianki zostaną uszkodzone, zmniejsz prędkość cięcia i zwiększ grubość przekroju, a następnie kontynuuj obserwację przekrojów pod mikroskopem świetlnym, aby precyzyjnie dostroić parametry cięcia.
- Skrawki należy przechowywać w temperaturze 4°C w roztworze KRB do czasu rozpoczęcia eksperymentów.
