Model organoidów guza pęcherza moczowego: metoda ortotopowego przeszczepu organoidów pęcherza moczowego do mysiego pęcherza biorcy

Streszczenie

Źródło: Kim, Y. et al. Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepy organoidów guza pęcherza moczowego myszy.J. Vis. Exp.(2020)

W tym filmie opisujemy ortotopową transplantację hodowanych organoidów guza pęcherza moczowego do mysiego pęcherza moczowego, aby zbadać rolę środowiska narządu w rozwoju nowotworów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Organoidy guza pęcherza moczowego subkultury
 

UWAGA: Zaleca się przejście organoidów guza pęcherza moczowego, gdy osiągną średnicę 100–150 μm.

1. Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego w 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i pożywki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
   nuta: Zbadaj organoidy wyizolowane z macierzy błony podstawnej pod mikroskopem. Jeśli organoidy nie zostaną odłączone od matrycy błony podstawnej, należy wydłużyć czas inkubacji lub odpipetować więcej razy.
2. Dodaj 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwiruj probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessaj supernatant.
3. Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA i 10 μM Y-27632. Inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Energicznie pipetuj komórki w górę iw dół i zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml DMEM z 10% FBS.
4. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
5. Zawiesić osad za pomocą 1 ml podgrzanego podłoża organoidowego i policzyć liczbę pojedynczych komórek nowotworowych.

2. Ortotopowy przeszczep organoidu pęcherza moczowego (Rysunek 1A)

1. Przygotuj organoidy guza pęcherza moczowego do przeszczepu ortotopowego
   1. Przed przeszczepem hoduj organoidy guza pęcherza moczowego przez 5-7 dni, jak opisano powyżej.
   2. Dodać 500 μl kolagenazy/dypazy do podłoża organoidowego na 24-dołkowej płytce z organoidami nowotworowymi. Pipetować w górę i w dół matrycy błony podstawnej i podłoża. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.
   3. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM, odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
   4. Zawiesić osad w 1 ml DMEM i przenieść roztwór na szalkę Petriego o średnicy 90 mm.
   5. Pod mikroskopem zbierz 10-100 organoidów nowotworowych za pomocą mikropipety P200 i zbierz je do mikroprobówki na lodzie.
   6. Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant.
   7. Utrzymuj osad komórkowy na lodzie, aż myszy będą gotowe do operacji.
2. Przeszczep ściany pęcherza podśluzówkowego
   1. Przygotuj 8- do 10-tygodniowego samca nagiej myszy (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) co najmniej 1 tydzień przed eksperymentem, aby umożliwić jej aklimatyzację w nowym środowisku. Enrofloksacynę (5 mg/kg) wstrzyknąć podskórnie 24 godziny przed zabiegiem.
   2. Wyczyść powierzchnię ławki wodą z mydłem. Autoklawuj narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem chirurgicznym i wykonaj operację przy użyciu sterylnych narzędzi.
   3. Strzykawkę insulinową 29 G, końcówki pipet i matrycę błony podstawnej należy przechowywać na lodzie. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie przed podaniem znieczulenia.
   4. Znieczulić mysz 4% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po uzyskaniu znieczulenia ogólnego połóż mysz w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie, wdychając maskę 2% odparowanego izofluranu.
      nuta: Jeśli czas znieczulenia przekracza 30 minut, nałóż maść do oczu na oba oczy za pomocą bawełnianego wacika, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
   5. Nałóż powidon-jod ze sterylną gazą i przetrzyj ją 70% etanolem. Powtórz 3x za każdym razem z nową gazą lub wacikiem.
   6. Zakryj odbyt i pole operacyjne za pomocą jednorazowych, sterylnych obłożeni chirurgicznych.
   7. Używając mikroskopu preparacyjnego do powiększenia, wykonaj małe poprzeczne nacięcie (mniejsze niż 1,5 cm) w skórze i ścianie mięśniowej dolnej linii środkowej brzucha za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych. Odsłoń pęcherz z jamy brzusznej i podeprzyj go wacikami nasączonymi solą fizjologiczną.
      nuta: Jeśli pęcherz jest wypełniony moczem, delikatnie dociśnij pęcherz, aby go lekko rozprężyć.
   8. Zawiesić osady organoidów w 80 μl pożywki organoidowej zawierającej 50% matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu (Tabela 1 i Tabela materiałów).
   9. Wstrzyknąć zawiesinę organoidową do przedniej części kopuły pęcherza moczowego za pomocą strzykawki insulinowej 29 G pod mikroskopem preparacyjnym
   .
   10. Zamknij wewnętrzną warstwę ściany brzucha antybakteryjnym szwem wchłanialnym, a następnie zamknij zewnętrzną warstwę nylonowym szwem 4-0. Zdezynfekować miejsce operacyjne jodonem powidonu i 70% etanolem.
   11. Pozwól myszy dojść do siebie pod promiennikiem podczerwieni przez 10–15 minut. Monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i ruchliwość.
   12. Dzień po zabiegu należy sprawdzić ogólny stan myszy i nieszczelność zespolenia. Ketoprofen (5 mg/kg) należy podawać raz na dobę przez 3 dni po operacji i leczyć enrofloksacynę (5 mg/kg mc.) raz na dobę przez 10 dni po operacji.
   13. Po zagojeniu się miejsca nacięcia (10–14 dni po zabiegu) należy zdjąć szwy. Monitoruj wzrost guza pęcherza myszy przez 2-3 tygodnie po wstrzyknięciu organoidu guza
   .
   14. Jeśli zaobserwuje się wzrost guza pęcherza moczowego, poddaj mysz eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenku węgla i zbierz cały guz pęcherza moczowego. Umyj go za pomocą zimnego DPBS (Rysunek 1B).
   15. Aby przeanalizować histologię guza pęcherza moczowego, wybarwić zatopiony w parafinie odcinek tkanki za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) (ryc. 1B).

Podłoże organoidowe guza pęcherza moczowego myszy
Zaawansowany DMEM/F-12 (Basic medium)	10 mM HEPES, (pH 7,4)
10 mM nikotynamidu	0,5x suplement bez serum
2 mM dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy	1% penicylina/streptomycyna
1 mM N-acetylo-L-cysteiny	50 ng / ml Mysi naskórkowy czynnik wzrostu
1 μM A 83-01

Tabela 1: Skład pożywki organoidowej guza pęcherza moczowego.

Wyniki

Rycina 1: Ortotopowy przeszczep organoidów guza pęcherza moczowego.(A) Schemat ideowy ortotopowego przeszczepu organoidów guza pęcherza moczowego do nagiej myszy. (B) Reprezentatywne obrazy pęcherzy moczowych i wycinków barwionych H&E od myszy ortotopowo przeszczepionych z organoidami guza pęcherza moczowego. Powiększone widoki obszarów ramkowyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka stożkowa 15 ml	Spl	Numer katalogowy: 50015
Płytka 24-dołkowa	Corning	3526
Strzykawka insulinowa 29 G 1/2	SHINA	B299473538
Probówka stożkowa 50 ml	Spl	Numer katalogowy 50050
A8301	Tocris powiedział:	Numer katalogowy: 2939	Stężenie kolby: 25 mM
Alkohol etylowy	Daejung powiedział:	Numer telefonu 4023-2304
Szew wchłanialny	Henryk Schein	Numer katalogowy: 039010
Zaawansowany DMEM/F-12	Thermo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (naga mysz)	Rzeka Karola	Rozdział 194
Kolagenaza typu I	Thermo	17100017	Stężenie podstawowe: 20 mg/ml
Kolagenaza typu II	Thermo	17100015	Stężenie podstawowe: 20 mg/ml
Kolagenaza/dypaza	Sigma	10269638001	Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
DMEM (zmodyfikowane minimalne niezbędne media firmy Dulbecco)	Gibco (firma Gibco)	Lata 11965-118
DMSO (sulcotlenek dimetylu)	Sigma	Zobacz materiał D8418
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco)	Welgene	LB 001-02
Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (GFR) Obniżony czynnik wzrostu (GFR)	Corning	Numer telefonu 354230	Stosować do hodowli organoidów na płytce
Matrigel o wysokim stężeniu (HC)	Corning	354248	Służy do przeszczepu organoidów
Mikroprobówka 1,5 ml	Axygen (Axigen	MCT-150-C
żyletka
Bufor soli fizjologicznej	JW Farmaceutyczny
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco (firma Gibco)	25200072
Probówka do ultrawirowania	Beckman Coulter	331372
Dichlorowodorek Y-27632	Abmole	Zobacz materiał M1817	Stężenie zapasów: 10 mM

TGL powiedział: ) powiedział: