Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie sond
- Przygotować sondy ze stopu tytanu i niklu (długość 40 mm; średnica 0,2 mm) pokryte sorbentem mieszanym o średnicy 7 mm. Liczba sond zależy od punktów czasowych docelowych podczas całej procedury oraz liczby powtórzeń (zalecane jest 3 na punkt czasowy).
nuta: Długość i rodzaj fazy ekstrakcji można dostosować w zależności od trybu badania, polarności metabolitów i matrycy próbki.
- Przygotować mieszaninę czyszczącą składającą się z chloroformu:metanolu w stosunku 2:1 (v/v). Pobrać pipetę po 1,0 ml roztworu do każdej szklanej fiolki o pojemności 2,0 ml i umieścić jedną sondę, uprzednio przebitą przez nakrętkę, w każdej fiolce.
nuta: Przed użyciem wyczyść wszystkie sondy, aby usunąć cząsteczki zanieczyszczające.
- Umieścić fiolki na mieszadle i ustawić prędkość mieszania na 1,200 obr./min. Po 45 minutach zatrzymaj urządzenie i spłucz powłoki wodą klasy LC-MS.
- Ponieważ powłoki muszą zostać poddane etapowi kondycjonowania wstępnego w celu ich aktywacji, należy przygotować mieszaninę kondycjonującą wstępnie składającą się z metanolu i wody w stosunku 1:1 (v/v). Odpipetować 1,0 ml roztworu do każdej szklanej fiolki o pojemności 2,0 ml i umieścić jedną sondę, uprzednio przebitą przez nakrętkę, w każdej fiolce.
- Umieścić fiolki na mieszadle wirowym i ustawić prędkość mieszania na 1,200 obr./min.
- Po 60 minutach należy zatrzymać mieszadło i spłukać powłoki wodą klasy LC-MS.
- Sterylizuj sondy zgodnie ze standardowym protokołem sterylizacji sprzętu chirurgicznego.
2. Ekstrakcja
- Otwórz sterylne opakowanie tuż przed pobraniem próbki, aby zapewnić sterylne środowisko.
- Włóż dwie sondy bezpośrednio do kory nerkowej na 10 minut w każdym punkcie czasowym. Cała długość powłoki musi być pokryta matrycą tkankową; Nie jest wymagany konkretny kąt, ale zwykle stosuje się ok. 90 stopni.
nuta: Cała procedura medyczna przebiega zgodnie ze standardowymi protokołami w danej placówce. Nie rozważa się żadnych modyfikacji dotyczących pobierania próbek SPME. Procedura obejmuje sześć następujących punktów czasowych pobierania próbek: a) przed resekcją nerki, in vivo od dawcy; b)–e) po 1 h, 3 h, 5 h, 7 h perfuzji nerkowej, ex vivo w komorze narządowej; f) po reperfuzji, in vivo od biorcy.
- Wycofaj sondy, wyciągając je z tkanki, a następnie spłucz powłoki wodą klasy LC-MS, aby usunąć pozostałą krew z powierzchni powłoki. Spłukać z miejsca operowanego i natychmiast po wyjęciu sond.
3. Transport i przechowywanie
- Umieścić sondy w oddzielnych fiolkach i zamknąć je.
- Umieścić fiolki w styropianowym pudełku wypełnionym suchym lodem lub w ciekłym azocie na czas transportu.
- Próbki należy przechowywać w zamrażarce (-80 °C) lub natychmiast rozpocząć etap desorpcji.
4. Desorpcja
- Przygotować roztwory desorpcyjne składające się z proporcji acetonitryl:woda (v/v) w proporcji 80:20 do analizy metabolomicznej i izopropanolu:metanolu (v/v) w stosunku 1:1 do analizy lipidomicznej.
- Pobrać pipetą 100 μl roztworu do wkładek umieszczonych w oznaczonych fiolkach o pojemności 2,0 ml i umieścić jedną sondę, uprzednio przebitą przez nakrętkę, w każdej fiolce.
- Umieścić fiolki na mieszadle wirowym i ustawić prędkość mieszania na 1 200 obr./min na 120 minut.
- Wyjąć sondy z fiolek. Uzyskane ekstrakty są teraz gotowe do analizy instrumentalnej.
5. Analiza LC-MS
- Umieścić fiolki z ekstraktami w automatycznym podajniku próbek systemu LC-MS.
nuta: W badaniach wykorzystano chromatografię cieczową (RP, HILIC) sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości i analizatorem mas orbitrap. Aby zapoznać się z parametrami analizy metabolomicznej, przejdź do kroku 5.2. Aby zapoznać się z parametrami analizy lipidomicznej, przejdź do kroku 5.6.
- Do separacji odwróconych faz należy użyć kolumny pentafluorofenylowej (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm).
- Ustaw natężenie przepływu na 300 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 25 °C.
- Przygotować fazy ruchome w następujących proporcjach: faza ruchoma A: woda: kwas mrówkowy (99,9:0,1, v/v) i faza ruchoma B: acetonitryl: kwas mrówkowy (99,9:0,1, v/v). Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: początkowy przepływ fazy ruchomej (0–3 min): 100% A, a następnie gradient liniowy do 10% A (3–25 min), kończący się przepływem izokratycznym 10% A do 34 min, po którym następuje 6 min czasu przywrócenia równowagi kolumny.
- Do separacji HILIC należy użyć kolumny HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200 A). Ustawić natężenie przepływu na 400 μl/min.
- Przygotować fazy ruchome zgodnie z następującymi proporcjami: faza ruchoma A: bufor acetonitryl: octan amonu (9:1, v/v, efektywne stężenie soli 20 mM), faza ruchoma B: bufor acetonitryl: octan amonu (1:1, v/v, efektywne stężenie soli 20 mM).
- Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: rozpocznij przepływ fazy ruchomej (0–3 min) przy 100% A, przytrzymaj przez 3,0 min, a następnie zwiększ do 100% B w ciągu 5 minut. Przytrzymaj ze 100% B do 12 min, a następnie 8 min czasu przywrócenia równowagi kolumny.
- Ustaw zakres skanowania na 85–1000 m/z. Ustaw parametry źródła jonów HESI w trybie jonizacji dodatniej na: napięcie natrysku 1 500 V, temperaturę kapilary 300 °C, gaz osłonowy 40 a.u., natężenie przepływu gazu pomocniczego 15 a.u., temperaturę grzałki sondy 300 °C, poziom RF S-Lens 55%.
- Przeprowadzaj kontrolę jakości próbek składających się z 10 μl każdej analizowanej próbki (regularnie, co 10–12 próbek) w celu monitorowania wydajności urządzenia.
- Do separacji odwróconych faz należy użyć kolumny C18 (2.1 mm x 75 mm, 3.5 μm).
- Ustaw natężenie przepływu na 200 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 55 °C. Przygotować fazy ruchome w następujących proporcjach: faza ruchoma A:H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM octan amonu i 1 mM kwas octowy; faza ruchoma B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM octan amonu i 1 mM kwas octowy.
- Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: 0–1 min (20% B), 1–1,5 min (20–50% B), 1,5–7,5 min (50–70% B), 7,5–13 min (70–95% B), 13–17 min (95% B), 17–17,1 min (95–20% B), 17,1–23 min (20%).
- Do separacji HILIC należy użyć kolumny HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).
- Ustaw natężenie przepływu na 400 μl/min, a temperaturę automatycznego podajnika próbek i kolumny odpowiednio na 4 °C i 40 °C.
- Przygotować fazy ruchome zgodnie z następującymi proporcjami: faza ruchoma A: ACN; faza ruchoma B: 5 mM octanu amonu w wodzie. Ustaw przepływ fazy ruchomej zgodnie z następującymi parametrami: 0–2 min (96% B), 2–15 min (96–80% B), 15–15,1 min (80–96% B), 15,1–21 min (96% B).
- Ustaw parametry źródła jonów HESI w trybie jonizacji dodatniej na napięcie natrysku 3 500 V, temperaturę kapilary 275 °C, gaz osłonowy 20 au, natężenie przepływu gazu pomocniczego 10 a.u., temperaturę grzałki sondy 300 °C, poziom RF S-Lens 55%.
- Przeprowadzaj kontrolę jakości próbek składających się z 10 μl każdej analizowanej próbki (co 10–12 próbek) w celu monitorowania wydajności urządzenia.
- Wykonaj akwizycję danych w oprogramowaniu kompatybilnym z urządzeniem.
6. Analiza danych
- Przetwarzanie danych, przypuszczalna identyfikacja i analiza statystyczna przy użyciu oprogramowania dedykowanego do nieukierunkowanej analizy metabolomicznej i lipidomicznej.
nuta: W celu wizualizacji struktury danych można uzyskać analizę głównych składowych (PCA) i wykresy pudełkowych.
