Barwienie zewnątrzkomórkowego DNA: metoda identyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w skrawkach tkanki FFPE

Streszczenie

Źródło: O'Sullivan, K. M. et al. Nadzorowane uczenie maszynowe do półkwantyfikacji zewnątrzkomórkowego DNA w kłębuszkowym zapaleniu nerek. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje technikę barwienia zewnątrzkomórkowego DNA w skrawkach tkanek FFPE. Barwione zewnątrzkomórkowe DNA można określić ilościowo w celu określenia skuteczności dowolnego leczenia terapeutycznego, które prowadzi do śmierci komórek rakowych.

Protokół

1. Barwienie dla ecDNA za pomocą DAPI i β-aktyny

1. Szkiełka podstawowe umieścić w suszarce w temperaturze 60 °C na 60 minut.
2. Zanurzyć szkiełka w dwóch zmianach rozpuszczalnika (ksylenu lub substytutu) na 40 minut każda, w dygestorium.
3. Nawilżaj szkiełka w 100% etanolu, 100% etanolu i 70% etanolu przez 5 minut każdy. Myć przez 5 minut w wodzie z kranu.
4. Umieść płytę grzejną w dygestorii i wstępnie zagotuj roztwór do odzyskiwania antygenu (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9,0) w szybkowarze. Gdy tylko roztwór do pobierania antygenu zacznie wrzeć, umieść szkiełka w garnku poziomo za pomocą szczypiec i zablokuj pokrywkę. Gotować na wysokim poziomie (co odpowiada 15 psi lub 103 kPa) przez 10 min.
   nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ pobiera interesujący nas antygen poprzez zdemaskowanie epitopu antygenu (usieciowanego poprzez utrwalanie formaliny), aby umożliwić wiązanie specyficzne dla przeciwciała epitopowego; Późniejsze barwienie nie będzie działać bez niego.
5. Zdejmij szybkowar z ognia i natychmiast zdejmij pokrywkę, przekręcając zimny kran na pokrywie w zlewie. Pozostaw szkiełka do równowagi przez 20 minut w roztworze do pobierania antygenu.
6. Przemyć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w 0,01 M roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (pH 7,4) na wytrząsarce orbitalnej.
7. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować kółka wokół tkanki nerkowej, uważając, aby w tym czasie żadna tkanka nie wyschła.
8. Tkankę blokową w 10% surowicy kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 30 minut, 60 μl na sekcję. Nie myj po tym etapie, ale ostrożnie usuń roztwór blokujący za pomocą pipety o pojemności 60 μl, nie pozwól, aby skrawki wyschły.
9. Zastosować pierwszorzędowy koktajl przeciwciał dla β-aktyny rozcieńczonej 1/1000 w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μl na sekcję i inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C.
10. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
11. Zastosować przeciwciało drugorzędowe, kurczak anty-królik 488 (1/200), 60 μl na sekcję rozcieńczone w 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
12. Myć szkiełka dwukrotnie przez 5 minut w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na wytrząsarce orbitalnej.
13. Zanurz szkiełka w 0,3% Sudan Black w 70% etanolu na 30 minut w słoiku z Coplin.
    nuta: Ten krok jest ważny, ponieważ wygasza autofluorescencję spowodowaną utrwaleniem formaliny.
14. Umyj szkiełka w wodzie z kranu, aby usunąć osad, a następnie zanurz w PBS (pH 7,4, 0,01 M) na 10 minut, aby zapobiec dalszemu tworzeniu się osadu Sudan Black.
15. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na konfokalnych szkiełkach nakrywkowych za pomocą trzech kropli 60 μl roztworu montażowego z DAPI i uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, nakładając je na całym obwodzie szkiełka nakrywkowego.
16. Pozostawić szkiełka do utwardzenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (aby umożliwić przenikanie DAPI), a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w chronionym przed światłem.
    nuta: Ważne, aby przechowywać w ciemności, aby zapobiec blaknięciu sond fluorescencyjnych.
17. Szkiełka obrazowe za pomocą konfokalnej głowicy skanującej laserowej przymocowanej do mikroskopu. Wzbudzić szkiełka za pomocą lasera 405 dla DAPI i lasera 488 dla Beta Actin. Przechwytywanie obrazów w jednej płaszczyźnie o wymiarach 1024 x 1024 pikseli przy użyciu sekwencyjnego przechwytywania liniowego i uśredniania 4-liniowego, co jest niezbędne do wykrywania ecDNA. Używany jest obiektyw olejowy 40x 1.0 NA.
    1. Należy zobrazować co najmniej 20 kłębuszków nerkowych na próbkę. Zapisywanie obrazów jako plików ND2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	Certyfikat A2153	Roztwory 5% i 1% są sporządzane w PBS, mogą być wytwarzane luzem i mrożone - wyrzucić po rozmrożeniu
Przeciwciało przeciw koziej IgG (H+L) wchłonięte krzyżowo kurczaka Alexa Fluor 594	ThermoFisher Naukowy	A-21468	Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom IgG (H+L) wchłoniętym krzyżowo, Alex Fluor 647	ThermoFisher Naukowy	A-121468	Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Przeciwciało przeciw królikowi IgG (H+L) wchłaniane krzyżowo Alexa Fluor 488	ThermoFisher Naukowy	A-21441	Wiruj w mini wirówce przez 1 minutę przed użyciem, aby uniknąć wolnego koniugatu w koktajlu przeciwciał
Surowice z kurczaka	Sigma	Zobacz materiał C5405	Składa się w 1% z BSA/PBS
Szkiełka nakrywkowe 24x60 mm	Azernaukowa	ES0107222	#1.5 To nie jest standardowa grubość przeznaczona do stosowania w mikroskopii konfokalnej
EDTA 10mM	Sigma	E6758	Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, w celu pobrania antygenu, można uzupełnić w 10-krotnym roztworze
Etanol 30%, 70% i 100%	Zaopatrzenie w chemię	UN1170	Dostarczany w postaci 100% niedenaturowanego etanolu - rozcieńczony do 30% i 70% przy użyciu wody destylowanej
Formaldehyd, 4% (10% neutralna buforowana formalina)	Trajan	NBF-500	Nerkę umieszcza się w probówce o pojemności 5 ml zawierającej 3 ml formaliny na 16 godzin w temperaturze pokojowej, formalinę należy stosować w dygestorio.
Szkiełka histologiczne szklane - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0mm	Trajan	J3800AM4	Niezbędne jest stosowanie dodatnio naładowanych prowadnic powlekanych. Nie zalecamy stosowania poli-L-lizyny do powlekania szkiełek, ponieważ tkanka przemieszcza się z szkiełek podczas etapu pobierania antygenu
Kozie przeciwciało przeciwko ludzkiemu / myszemu MPO	Prace badawczo-rozwojowe	AF3667	Porcja i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przyjeździe
Długopis hydrofobowy	Laboratoria VECTOR	H-400	Służy do rysowania okręgu wokół tkanki nerkowej
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	Zobacz materiał P38135	0,01 mln PB/0,09% NaCl Uzupełnij jednorazowo 5 l
Szybkowar 6L Tefal secure 5 Neo nierdzewny	Tefal	GSA-P2530738	Zakupione w lokalnym sklepie z artykułami gospodarstwa domowego
Przedłuż złoto DAPI	Technologie życiowe	Zobacz materiał P36962	Nakładaj krople bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe
Królicze przeciwciało anty ludzkie/mysie Beta aktyna	ABCAM (ABCAM)	ab8227	Porcja i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przyjeździe
Królicze przeciwciało przeciwko człowiekowi/myszy H3Cit	ABCAM (ABCAM)	ab5103	Porcja i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni po przyjeździe
Stojak do barwienia 24 szkiełka	Firma ProScitech	Zobacz materiał H4465	Wybrany stojak do barwienia musi być w stanie wytrzymać gotowanie pod ciśnieniem i inkubację w piekarniku o temperaturze 60 stopni
Sudan B	Sigma	199664	0,3% Do butelki o pojemności 1L wsypać 3g w 70% etanolu, przefiltrować i chronić przed światłem - stabilny przez 6 miesięcy w temperaturze pokojowej
Tris 10mM	Sigma	Zobacz materiał T4661	Dodaj TRIS i EDTA razem w wodzie destylowanej i pH do 9, w celu pobrania antygenu, można uzupełnić w 10-krotnym roztworze
ksylen	Trajan	XL005/20	Musi być używany w dygestoriach