Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
2.9K wyświetleń
⸱
30 kwietnia 2023
Źródło: Burt, M. et al. Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w chemicznie zdefiniowanych warunkach. J. Vis. Exp. (2020)
W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.
1. Przygotowanie odczynników
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórek | |||
| Ludzkie komórki iPS DU11 | Linia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke University iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Linia ta została przetestowana pod kątem mykoplazmy i została ostatnio kariotypowana w lipcu 2019 r. przez nasze laboratorium i stwierdzono, że jest kariotypowo normalna. | ||
| Czynniki wzrostu i suplementy pożywkowe | |||
| Kwas all-trans retinowy (500 mg) | Numer katalogowy: 72262 | Technologie komórek macierzystych | |
| Suplement diety bez surowicy B27 | 17504044 | Technologie Thermo/Life | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent (Łodyga | Może wykazywać różnice między partiami |
| Kompletny zestaw średni z CultureBoost-R (Wzmacniacz Kultury-R) | 4Z0-500-R | Systemy komórkowe | Pożywki do konserwacji podocytów |
| DMEM/F12 | 12634028 | Technologie Thermo/Life | |
| DMEM/F12 z suplementem GlutaMAX | 10565042 | Technologie Thermo/Life | DMEM/F12 z suplementem glutaminy |
| Inaktywowany termicznie FBS | 10082147 | Technologie Thermo/Life | |
| Ludzka aktywina A | PHC9564 | Technologie Thermo/Life | |
| Ludzki BMP7 | PHC9544 | Technologie Thermo/Life | |
| Ludzki VEGF | PHC9394 | Technologie Thermo/Life | |
| mTeSR1 średni | Numer katalogowy: 05850 | Technologie komórek macierzystych | Pożywki do hodowli komórkowych hiPS (CCM) |
| Penicylina-streptomycyna, płyn (100×) | Rozdział 15140-163 | Technologie Thermo/Life | |
| Y27632 Inhibitor ROCK | 1254 | Tocris powiedział: | |
| przeciwciała | |||
| Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 594 | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Technologie Thermo/Life | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Księga Abcam | |
| Nefryna | GP-N2 (odbiornik GP-N2 | Pochodzenie | |
| PAŹ 4 | AF1759 | Systemy badawczo-rozwojowe | |
| PAX2 (wersja 2 | Nr kat. 71-6000 | Invitrogen | |
| Element ZAWI1 | MAB4234 | Milipory | |
| Cząsteczki ECM | |||
| iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai, Ameryka Północna | Matryca membrany podstawnej (BM) 2 |
| Matrigel z matrycą kwalifikowaną do zakażenia wirusem hESC, fiolka 5 ml | 354277 | BD Nauki biologiczne | Matryca membrany podstawnej (BM) 1. Może wykazywać różnice między partiami |
| Enzymy i inne odczynniki | |||
| Dokładności | A1110501 | Technologie Thermo/Life | Rozwiązanie do odłączania komórek |
| Bsa | Nr kat. A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Zobacz materiał D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO jest toksyczny. Należy obchodzić się z kapturem bezpieczeństwa chemicznego |
| Bezenzymatyczny bufor dysocjacyjny komórek, zrównoważona sól Hanka | 13150016 | Technologie Thermo/Life | |
| Roztwór etanolu, 70% (obj./obj.), klasy biotechnologicznej | Numer katalogowy: 97065-058 | Firma VWR | Etanol jest łatwopalny i toksyczny |
| FBS (Sieć Usługowa | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Numer katalogowy: 28906 | Technologie Thermo/Life | PFA należy obchodzić się z dygestorium chemicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Nr kat. 14190-250 | Technologie Thermo/Life | |
| Sterylna woda destylowana | 15230162 | Technologie Thermo/Life | |
| Tryton X-100 | Numer katalogowy: 97062-208 | Firma VWR | |
| Trypsyna-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Technologie Thermo/Life | |
| sprzęt | |||
| Pipety zasysające, pakowane pojedynczo | 29442-462 | Corning | |
| Wirówka Avanti J-15R | Zobacz materiał B99516 | Beckman Coulter | |
| Stożkowa probówka wirówkowa, 15 ml | 352097 | Corning | |
| Stożkowa probówka wirówkowa, 50 ml | 352098 | Corning | |
| Pudełka kriogeniczne | 3395465 | Technologie Thermo/Life | Do przechowywania zamrożonych podwielokrotności |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Technologie Thermo/Life | Mikroskop fluorescencyjny służący do pozyskiwania obrazów utrwalonych i barwionych komórek iPS oraz ich pochodnych |
| Hemocytometr | Numer katalogowy: 100503-092 | Firma VWR | |
| Inkubator CO2 Heracell VIOS 160i | 51030403 | Technologie Thermo/Life | Do rutynowej hodowli i konserwacji komórek iPS i ich pochodnych |
| Odwrócony Zeiss Axio Observer wyposażony w kamerę AxioCam 503 | 491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(aparat fotograficzny) | Mikroskopia Carla Zeissa | Służy do pozyskiwania obrazów z kontrastem fazowym żywych komórek iPS i ich pochodnych na każdym etapie różnicowania podocytów |
| Rękawice nitrylowe Kimberly-Clark | Numer katalogowy: 40101-346 | Firma VWR | |
| Chusteczki kimowe, duże | 21905-049 | Firma VWR | |
| Chusteczki kimowe, małe | 21905-026 | Firma VWR | |
| Precyzyjne końcówki do pipet barierowych P10 | P1096-FR | Naukowy Denville | |
| Końcówki do pipet barierowych P100 | Zobacz materiał P1125 | Naukowy Denville | |
| Barierowe końcówki do pipet P1000 | Zobacz materiał P1126 | Naukowy Denville | |
| Barierowe końcówki do pipet P20 | Zobacz materiał P1121 | Naukowy Denville | |
| Barierowe końcówki do pipet P200 | Zobacz materiał P1122 | Naukowy Denville | |
| Pipeta serologiczna, 10 ml, pakowana pojedynczo | 356551 | Corning | |
| Pipeta serologiczna, 25 ml, pakowana pojedynczo | 356525 | Corning | |
| Pipeta serologiczna, 5 ml, pakowana pojedynczo | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Milipore | |
| Sterylne probówki do mikrowirówek | Numer katalogowy: 1138W14 | Thomas Naukowy | Do porcjowania czynników wzrostu |
| Płytki 12-dołkowe poddane hodowli tkankowej | 353043 | Corning | |
| Płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowej | 353046 | Corning | |
| Biały fartuch laboratoryjny VWR techuni | Numer katalogowy: 10141-342 | Firma VWR | |
| Podnośnik komórek z szerokim skosem | Numer katalogowy 3008 | Corning |
