Pozyskiwanie ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych: procedura ukierunkowanego różnicowania dojrzałych podocytów nerkowych z komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Burt, M. et al. Sterowane różnicowanie dojrzałych podocytów nerkowych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w chemicznie zdefiniowanych warunkach. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich podocytów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez różnicowanie komórek w określonych warunkach chemicznych. Wygenerowane podocyty mogą być wykorzystane do badań nefrotoksyczności i modelowania chorób.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Rozcieńczyć 5x suplement pożywki do hodowli komórkowych hiPS (CCM) w pożywce podstawowej do hodowli komórkowych hiPS, aby otrzymać 1x roztwór hiPS CCM.
   nuta: Mrożony suplement 5x hiPS CCM wymaga powolnego procesu rozmrażania, najlepiej w temperaturze 4 °C na noc. Podwielokrotności 1x hiPS CCM mogą być przechowywane do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie płytek pokrytych błoną podstawną (BM) o matrycy 1 do hodowli komórek hiPS: Rozmrozić BM matrix 1 przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotować podwielokrotności o odpowiednich współczynnikach rozcieńczenia, zgodnie z zaleceniami producenta.
   nuta: Zazwyczaj podwielokrotności przygotowuje się do późniejszego rozcieńczenia w 25 ml zimnego DMEM/F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie dokładnego wymieszania w celu całkowitego rozpuszczenia matrycy BM 1 i uniknięcia tworzenia się pozostałych kryształów.
3. Przenieść 1 ml roztworu BM matrix 1 do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, owinięty folią parafinową. Płytki powlekane BM matrix 1 można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
4. Przygotowanie płytek z membraną podstawną (BM) na matrycy 2: Rozcieńczyć odpowiednie ilości matrycy BM 2 w 9 ml sterylnej wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml. Dodać 700 μl roztworu BM matrix 2 do każdego dołka na płytce 12-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Przygotować po 100 μg/ml roztworów podstawowych BMP7, Activin A i VEGF w następujący sposób: Rozpuść BMP7 w sterylnej wodzie destylowanej zawierającej 0,1% (wag./obj.) BSA i rozpuść Activinę A i VEGF oddzielnie w sterylnym PBS zawierającym 0,1% (wag./obj.) BSA. Aby uniknąć częstych cykli zamrażania i rozmrażania, należy przygotować 100 μl porcji z każdego roztworu podstawowego i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
6. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy Y27632, rozpuszczając 10 mg Y27632 w 3,079 ml sterylnej wody destylowanej. Podać 100 μl z magazynu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
7. Rozpuścić 2 mg CHIR99021 w 143,4 μl sterylnego DMSO, aby przygotować 30 mM roztwór podstawowy. Przygotować 5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca (lub zgodnie z zaleceniami producenta).
8. Rozpuść 10 mg kwasu all-trans retinowego w 3,33 ml sterylnego DMSO. Przygotować 500 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Przygotowanie pożywek hodowlanych

1. Przygotować pożywkę do różnicowania mezodermy, rozpuszczając odpowiednie roztwory podstawowe do końcowego stężenia 100 ng/ml aktywiny A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 i 1x B27 suplementu bez surowicy w odpowiedniej objętości DMEM/12 z suplementem glutaminy.
   nuta: Pożywka do różnicowania mezodermy powinna być świeżo przygotowana przed etapami różnicowania i w objętości odpowiedniej do skali doświadczenia (zazwyczaj 50 ml pożywki jest odpowiednie dla dwóch płytek 12-dołkowych).
2. Przygotować pośrednią pożywkę do różnicowania mezodermy, odtwarzając odpowiednie roztwory podstawowe do końcowego stężenia 100 ng / ml BMP7, 3 μM CHIR99021 i 1x B27 suplement bez surowicy w DMEM/F12 z suplementem glutaminy.
   nuta: W razie potrzeby pożywkę można uzupełnić 1% (obj./obj.) penicyliną-streptomycyną. Dostosuj objętość pożywki za pomocą DMEM/F12 z suplementem glutaminy. Podłoże to można przygotowywać w dużych partiach; jednak zaleca się przechowywanie w mniejszych porcjach (np. 45 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml), aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Nośnik ten można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy, a przed użyciem można go rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc.
3. Przygotuj pożywkę do indukcji podocytów, odtwarzając do końcowego stężenia 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml aktywiny A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplement B27 bez surowicy i 0,1 μM kwasu all-trans retinowego w DMEM/F12 z suplementem glutaminy. Chronić podłoże przed światłem (np. owijając pojemnik papierem foliowym).
   nuta: Pożywka ta może być przygotowywana w dużych partiach i przechowywana w ciemności w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. Zamrożone porcje należy rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C przed użyciem.
4. Przygotować 25 ml roztworu neutralizującego trypsynę, dodając 10% (obj./obj.) inaktywowanego termicznie FBS w DMEM/F12 i przefiltrować w sterylnych warunkach.
5. W celu utrzymania podocytów pochodzących z komórek macierzystych po różnicowaniu należy przygotować Complete Medium z pożywką podtrzymującą podocyty, dodając suplement do podłoża podstawowego zgodnie z wytycznymi producenta i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.

3. Hodowla komórek hiPS bez karmienia przy użyciu pożywki do hodowli komórkowych hiPS

1. Odessać pozostały roztwór matrycy BM 1 z wstępnie powlekanych płytek i przemyć studzienki 3 razy 1 do 2 ml ogrzanego DMEM/F12.
2. Odessać zużyty hiPS CCM z komórek hiPS i przepłukać komórki 3 razy podgrzanym DMEM/F12. Dodać 1 ml roztworu do odrywania ciepłych komórek i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, aby pomóc w dysocjacji komórek. Przeprowadzić oględziny komórek pod mikroskopem hodowli tkankowych i upewnić się, że krawędzie kolonii komórkowych wydają się zaokrąglone, a następnie szybko odessać roztwór do odrywania komórek od komórek (upewniając się, że kolonie komórkowe są nadal przyczepione do płytki, choć luźno). Delikatnie przepłucz komórki raz za pomocą DMEM/F12, aby usunąć roztwór odłączający komórki.
3. Dodać 3 ml hiPS CCM do komórek hiPS (w każdym dołku płytki 6-dołkowej), które potraktowano roztworem do oddzielania komórek. Zeskrob kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby usunąć luźno przylegające komórki. Dokładnie umyj płytkę, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
   nuta: Zaleca się użycie pipety o pojemności 5 ml, aby uniknąć nadmiernego ścinania komórek.
4. Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórek do każdej studzienki nowej 6-dołkowej płytki z matrycą BM pokrytej 1 powłoką zawierającą 2 ml hiPS CCM na studzienkę. Przesunąć płytkę w kształcie ósemki, aby rozmieścić kolonie komórek w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5 % CO_{2 .} Odświeżać pożywkę codziennie, aż komórki będą gotowe do pasażowania lub wykorzystania w doświadczeniu różnicowania (około 70 % konfluencji).
   nuta: Idealna wielkość kolonii do rutynowego pasażowania iPSC wynosi od 200 do 500 μm w warunkach bez zasilania przy użyciu hiPS CCM (bez inhibitora ROCK). Jeśli komórki zostaną zindywidualizowane podczas leczenia enzymami dysocjacyjnymi lub, hiPS CCM można uzupełnić inhibitorem ROCK (np. 10 μM Y27632) w celu poprawy żywotności komórek.

4. Różnicowanie komórek hiPS w komórki mezodermy (dni 0–2)

1. Podczas gdy hodowle komórek hiPS znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego (w przybliżeniu w ciągu 4 dni hodowli po pasażowaniu i około 70% zbiegu), sprawdź wzrokowo obecność spontanicznie zróżnicowanych komórek na obrzeżach kolonii i wokół nich. W razie potrzeby asepcie zeskrobać obszary różnicowania.
2. Odessać hiPS CCM z komórek hiPS i przepłukać komórki 3 razy ciepłym DMEM/F12. Inkubować komórki z 1 ml bezenzymatycznego buforu do dysocjacji komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C i sprawdzić dysocjację pod mikroskopem. Ze względu na nieodłączne różnice między różnymi liniami komórkowymi hiPS, rzeczywisty czas inkubacji bufora dysocjacji komórek musi być określony dla danej linii komórkowej.
3. Delikatnie zeskrob studzienkę za pomocą podnośnika do komórek, aby usunąć luźno przylegające komórki i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby zindywidualizować komórki hiPS.
   1. Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 15 ml za pomocą ciepłego DMEM/F12 i wirować przez 5 minut przy 290 x g w temperaturze pokojowej.
   2. Delikatnie zassać supernatant i ponownie zawiesić komórki ciepłym DMEM/F12 do kolejnej rundy wirowania w celu usunięcia resztkowych składników BM matrycy 1 i buforu dysocjacyjnego.
4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do indukcji mezodermy, jak opisano powyżej. Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub licznika redlic w celu określenia odpowiedniej objętości pożywki różnicującej mezodermę, niezbędnej do osiągnięcia stężenia 1 x 10⁵ komórek/ml.
5. Odessać roztwór ECM z płytek powlekanych matrycą BM 2 i dwukrotnie przepłukać płytki ciepłym DMEM/F12. Zawiesinę komórek hiPS należy delikatnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując. Przenieś 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka 12-dołkowych płytek z matrycą BM pokrytą 2, a następnie delikatnie potrząśnij płytkami, aby rozprowadzić komórki bardziej równomiernie.
6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .} Odśwież pożywkę indukcyjną mezodermy następnego dnia.
   nuta: Po 2 dniach komórki mezodermy pochodzące z komórek hiPS byłyby gotowe do pośredniej indukcji mezodermy.

5. Różnicowanie komórek mezodermy pochodzących z komórek hiPS w mezodermę pośrednią (dni 2–16)

1. W 2 dniu protokołu różnicowania odessać pożywkę do indukcji mezodermy i uzupełnić 1 ml na dołek pośrednią pożywkę indukcyjną mezodermy.
2. Codziennie odświeżaj pożywkę, aby utrzymać dokładny próg czynników wzrostu i małych cząsteczek dla metabolicznie aktywnych komórek. Jeśli występuje znaczny wzrost komórek i szybkie wyczerpywanie się składników odżywczych pożywki (na co wskazuje żółknięcie pożywki), objętość pożywki do różnicowania mezodermy pośredniej można zwiększyć do 1,3 ml na studzienkę 12-dołkowych płytek.
3. Hoduj komórki przez dodatkowe 14 dni w celu uzyskania pośrednich komórek mezodermy. Do 16 dnia komórki te można poddać kriokonserwacji do późniejszego wykorzystania.

6. Różnicowanie pośrednich komórek mezodermy pochodzących z komórek hiPS w podocyty (dni 16–21)

1. Przepłukać pośrednie komórki mezodermy ciepłym DMEM/F12, a następnie przeprowadzić inkubację komórek z 0,5 ml na studzienkę 0,05 % trypsyny-EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Przeprowadzić oględziny, aby upewnić się, że komórki zaczynają się dysocjować.
2. Zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i kilkakrotnie odpipetować zawiesinę komórek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać pojedyncze (lub małe grudki) komórek.
   nuta: Na tym etapie upewnij się, że komórki są w pełni zdysocjowane, ponieważ zagregowane komórki mogą nie uzyskać terminalnie zróżnicowanego fenotypu w czasie protokołu.
3. Dodaj około 2 ml na studzienkę roztworu neutralizującego trypsynę, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
4. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą DMEM/F12, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 201 x g w temperaturze pokojowej.
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce indukcyjnej podocytów. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy zapewnić końcową gęstość wysiewu około 100 000 komórek/dołek na 12-dołkowej płytce. Dodaj zawiesinę komórek do płytek pokrytych matrycą BM 2 i delikatnie potrząśnij płytką, aby pomóc w bardziej równomiernym rozprowadzeniu komórek.
6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i codziennie odświeżać pożywkę przez okres do 5 dni, aby uzyskać podocyty do 21,< dnia / > nuta: Powstałe podocyty pochodzące z komórek hiPS można utrzymywać w hodowli przez dodatkowe 2–4 tygodnie przy użyciu kompletnej pożywki z pożywką podtrzymującą podocyty. Po umieszczeniu w pożywce podtrzymującej podocyty komórki mogą być karmione co drugi dzień i mogą być wykorzystywane do dalszych badań lub dalszych analiz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórek
Ludzkie komórki iPS DU11			Linia komórkowa iPS DU11 (klon Duke University #11) została wygenerowana w Duke University iPSC Core Facility i dostarczona nam przez Bursac Lab na Uniwersytecie Duke'a. Linia ta została przetestowana pod kątem mykoplazmy i została ostatnio kariotypowana w lipcu 2019 r. przez nasze laboratorium i stwierdzono, że jest kariotypowo normalna.
Czynniki wzrostu i suplementy pożywkowe
Kwas all-trans retinowy (500 mg)	Numer katalogowy: 72262	Technologie komórek macierzystych
Suplement diety bez surowicy B27	17504044	Technologie Thermo/Life
CHIR99021	04-0004	Stemgent (Łodyga	Może wykazywać różnice między partiami
Kompletny zestaw średni z CultureBoost-R (Wzmacniacz Kultury-R)	4Z0-500-R	Systemy komórkowe	Pożywki do konserwacji podocytów
DMEM/F12	12634028	Technologie Thermo/Life
DMEM/F12 z suplementem GlutaMAX	10565042	Technologie Thermo/Life	DMEM/F12 z suplementem glutaminy
Inaktywowany termicznie FBS	10082147	Technologie Thermo/Life
Ludzka aktywina A	PHC9564	Technologie Thermo/Life
Ludzki BMP7	PHC9544	Technologie Thermo/Life
Ludzki VEGF	PHC9394	Technologie Thermo/Life
mTeSR1 średni	Numer katalogowy: 05850	Technologie komórek macierzystych	Pożywki do hodowli komórkowych hiPS (CCM)
Penicylina-streptomycyna, płyn (100×)	Rozdział 15140-163	Technologie Thermo/Life
Y27632 Inhibitor ROCK	1254	Tocris powiedział:
przeciwciała
Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 594	A32744; A32754; A-11076; A32790	Technologie Thermo/Life
Brachyury(T)	ab20680	Księga Abcam
Nefryna	GP-N2 (odbiornik GP-N2	Pochodzenie
PAŹ 4	AF1759	Systemy badawczo-rozwojowe
PAX2 (wersja 2	Nr kat. 71-6000	Invitrogen
Element ZAWI1	MAB4234	Milipory
Cząsteczki ECM
iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) fragment	N-892012	Iwai, Ameryka Północna	Matryca membrany podstawnej (BM) 2
Matrigel z matrycą kwalifikowaną do zakażenia wirusem hESC, fiolka 5 ml	354277	BD Nauki biologiczne	Matryca membrany podstawnej (BM) 1. Może wykazywać różnice między partiami
Enzymy i inne odczynniki
Dokładności	A1110501	Technologie Thermo/Life	Rozwiązanie do odłączania komórek
Bsa	Nr kat. A9418	Sigma-Aldrich
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Zobacz materiał D2438	Sigma-Aldrich	DMSO jest toksyczny. Należy obchodzić się z kapturem bezpieczeństwa chemicznego
Bezenzymatyczny bufor dysocjacyjny komórek, zrównoważona sól Hanka	13150016	Technologie Thermo/Life
Roztwór etanolu, 70% (obj./obj.), klasy biotechnologicznej	Numer katalogowy: 97065-058	Firma VWR	Etanol jest łatwopalny i toksyczny
FBS (Sieć Usługowa	431097	Corning
Paraformaldehyd (PFA)	Numer katalogowy: 28906	Technologie Thermo/Life	PFA należy obchodzić się z dygestorium chemicznego przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Nr kat. 14190-250	Technologie Thermo/Life
Sterylna woda destylowana	15230162	Technologie Thermo/Life
Tryton X-100	Numer katalogowy: 97062-208	Firma VWR
Trypsyna-EDTA, 0,05%	25300-120	Technologie Thermo/Life
sprzęt
Pipety zasysające, pakowane pojedynczo	29442-462	Corning
Wirówka Avanti J-15R	Zobacz materiał B99516	Beckman Coulter
Stożkowa probówka wirówkowa, 15 ml	352097	Corning
Stożkowa probówka wirówkowa, 50 ml	352098	Corning
Pudełka kriogeniczne	3395465	Technologie Thermo/Life	Do przechowywania zamrożonych podwielokrotności
EVOS M7000	AMF7000	Technologie Thermo/Life	Mikroskop fluorescencyjny służący do pozyskiwania obrazów utrwalonych i barwionych komórek iPS oraz ich pochodnych
Hemocytometr	Numer katalogowy: 100503-092	Firma VWR
Inkubator CO2 Heracell VIOS 160i	51030403	Technologie Thermo/Life	Do rutynowej hodowli i konserwacji komórek iPS i ich pochodnych
Odwrócony Zeiss Axio Observer wyposażony w kamerę AxioCam 503	491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(aparat fotograficzny)	Mikroskopia Carla Zeissa	Służy do pozyskiwania obrazów z kontrastem fazowym żywych komórek iPS i ich pochodnych na każdym etapie różnicowania podocytów
Rękawice nitrylowe Kimberly-Clark	Numer katalogowy: 40101-346	Firma VWR
Chusteczki kimowe, duże	21905-049	Firma VWR
Chusteczki kimowe, małe	21905-026	Firma VWR
Precyzyjne końcówki do pipet barierowych P10	P1096-FR	Naukowy Denville
Końcówki do pipet barierowych P100	Zobacz materiał P1125	Naukowy Denville
Barierowe końcówki do pipet P1000	Zobacz materiał P1126	Naukowy Denville
Barierowe końcówki do pipet P20	Zobacz materiał P1121	Naukowy Denville
Barierowe końcówki do pipet P200	Zobacz materiał P1122	Naukowy Denville
Pipeta serologiczna, 10 ml, pakowana pojedynczo	356551	Corning
Pipeta serologiczna, 25 ml, pakowana pojedynczo	356525	Corning
Pipeta serologiczna, 5 ml, pakowana pojedynczo	356543	Corning
Steriflip, 0,22 μm, PES	SCGP00525	EMD Milipore
Sterylne probówki do mikrowirówek	Numer katalogowy: 1138W14	Thomas Naukowy	Do porcjowania czynników wzrostu
Płytki 12-dołkowe poddane hodowli tkankowej	353043	Corning
Płytki 6-dołkowe poddane kulturze tkankowej	353046	Corning
Biały fartuch laboratoryjny VWR techuni	Numer katalogowy: 10141-342	Firma VWR
Podnośnik komórek z szerokim skosem	Numer katalogowy 3008	Corning

) szt. powiedział: powiedział: ) powiedział: ) powiedział: