Izolacja komórek mięśni gładkich Detrusor: procedura trawienia enzymatycznego w celu uzyskania komórek DSM z próbek ludzkiego pęcherza moczowego

Streszczenie

Źródło: Małysz, J. et al. Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich ludzkiego wypieracza do charakterystyki prądów kationowych wrażliwych na 9-fenantrol. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie pokazujemy izolację komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego za pomocą dwuetapowej sekwencyjnej obróbki enzymatycznej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Rozwarstwienie tkanek DSM i przygotowanie kawałków DSM wolnych od błony śluzowej

1. Zbadaj próbkę pęcherza moczowego o całej grubości, która dotarła do laboratorium z sali operacyjnej w szczelnie zamkniętym pojemniku wypełnionym zimnym roztworem do rozwarstwiania/trawienia (Rysunek 1 i Tabela 1 dla składu DS).
   nuta: Próbka jest zwykle przechowywana w zimnym DS od kilku godzin do nocy przed przybyciem do laboratorium. W celu dłuższego przechowywania, DS (Tabela 1) jest uzupełniany o 1 mM CaCl₂.
2. Usuń i spłucz ludzką próbkę DSM o całej grubości (zawierającą wszystkie warstwy, w tym błonę śluzową, DSM i błonę surowiczą) lodowatym DS, aby wypłukać przyczepione zanieczyszczenia i krew.
3. Przypnij próbkę pęcherza moczowego, błoną śluzową skierowaną do góry i surowiczą w dół, na pokrytym silikonowym enancjomerem (tabela materiałów) okrągłym naczyniu o średnicy 150 mm wypełnionym lodowatym DS (ryc. 1B).
4. Usuń sąsiednią tkankę tłuszczową, naczynia krwionośne, nabłonek (nabłonek dróg moczowych) i błonę śluzową mięśni z próbki przez ostre wypreparowanie za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
5. Wytnij kilka wolnych od błony śluzowej kawałków DSM (~2–3 mm długości i 4–6 mm szerokości) (Rysunek 1C).

2. Enzymatyczna dysocjacja fragmentów DSM, w wyniku której powstają świeżo wyizolowane pojedyncze komórki DSM.

1. Umieścić od 3 do 6 kawałków DSM w probówce zawierającej od 1 do 2 ml wstępnie podgrzanego (~37 °C) DS zawierającego papainę i ditiotreitol (DS-P, Tabela 1) i inkubować kawałki DSM w DS-P przez 30–45 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (raz na 10–15 minut).
   nuta: Aby optymalnie kontrolować temperaturę obróbki enzymatycznej, probówki z kawałkami tkanek i roztworami enzymów umieszcza się w szklanej komorze na chusteczki wypełnionej wodą podłączoną do cyrkulującej podgrzewanej łaźni wodnej (rysunek 1D) lub w bardzo precyzyjnej łaźni wodnej z kontrolowaną temperaturą (rysunek 1E).
2. Wyjmij DS-P z tuby, krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS, wyrzuć zimny DS z tubki, pozostawiając kawałki DSM na dnie tubki.
3. Dodać 1 do 2 ml kolagenazy typu II (DS-C, tabela 1) zawierającej DS do probówki z kawałkami DSM; delikatnie wymieszać i inkubować przez 25–40 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (co 10–15 minut).
4. Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów 5–10 razy lodowatym DS.
5. Po ostatnim płukaniu pozostawić roztwór DS w probówce; delikatnie rozetrzeć kilkakrotnie wypolerowaną pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM.
6. Umieść kilka kropli roztworu DS zawierającego rozproszone komórki DSM w komorze ze szklanym dnem lub szkiełku nakrywkowym i sprawdź wzrokowo jakość pod mikroskopem (przy użyciu obiektywu 20x lub 40x) po co najmniej 5 minutach od aplikacji, aby komórki przylegały do dna.
7. Świeżo wyizolowane komórki DSM należy natychmiast wykorzystać do eksperymentów elektrofizjologicznych lub przechowywać komórki w probówce zawierającej DS w temperaturze ~4 °C na lodzie lub w lodówce do czasu użycia (zwykle do 8 godzin przygotowania).
   nuta: W ramach tego samego preparatu jakość komórek waha się od wysoce żywotnych do nadmiernie strawionych, martwych komórek DSM (ryc. 2). Gdy sekwencyjna metoda papainy-kolagenazy daje bardzo dużą liczbę niezdolnych do życia komórek, preparat jest odrzucany i przeprowadza się nowe trawienie kawałków DSM, ale ze skróconymi odstępami między inkubacjami. Jeśli w wyniku zabiegu powstaje zbyt mało komórek DSM, wówczas w celu późniejszego trawienia kawałków DSM wydłuża się odstępy między inkubacjami. Dodatnia immunoreaktywność na aktynę α mięśni gładkich potwierdza tożsamość komórek DSM (ryc. 3).

Typ rozwiązania	Skład (w mM)
DS (roztwór do rozwarstwiania/trawienia)	80 Na-glutaminian, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 i 11 glukozy, pH dostosowane do 7,4 (z 10 M NaOH)
DS-P (DS zawierający papainę)	DS zawierające 1-2 mg/ml papainy, 1 mg/ml ditiotreitolu i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej
DS-C (DS zawierający kolagenazę)	Roztwór DS zawierający 1-2 mg/ml kolagenazy typu II, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0 lub 1 mg/ml inhibitora trypsyny i 100-200 μM Ca2+
P (Pipeta)	110 CsOH, 110 kwas asparaginowy, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA i 30 CsCl, pH dostosowane do 7,2 z CsOH i uzupełnione amfoterycyną-B (300-500 μg / ml)
E (Pozakomórkowy)	10 chlorek tetraetyloamoniowy (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES i 10 glukozy, pH dostosowane do 7,3-7,4 z NaOH lub CsOH i 0,002-3 (2-3 mM) nifedypina

Tabela 1: Skład roztworu do rozwarstwiania/trawienia (DS) oraz roztworów pipetowych i zewnątrzkomórkowych stosowanych w eksperymentach z perforowanymi zaciskami krosowymi.

Wyniki

Rycina 1: Podsumowanie etapów rozwarstwiania prowadzących do przygotowania fragmentów i konfiguracji mięśni gładkich wypieracza (DSM) stosowanych do dysocjacji enzymatycznej. Pokazane są obrazy: (A) próbki ludzkiego pęcherza moczowego o pełnej grubości dostarczonej z operacji na otwartym pęcherzu moczowym jako obcy materiał chirurgiczny w lodowatym DS, (B)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5 ml polistyrenowej rurki okrągłodennej	sokół	352054	Probówki do DS zawierające enzymy stosowane na etapach trawienia
Analogowy mikser wirowy	Firma VWR	Nr kat. 58816-121
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016	Roztwór zewnątrzkomórkowy i DS
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889	Chelator Ca2+, stosowany w wewnątrzkomórkowym roztworze pipet
glukoza	Sigma	Kontroler G8270
Kolagenaza typu 2	Korporacja Biochemiczna Worthington	LS004177	DS-C
Hydrat wodorotlenku cezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8518	Roztwór do pipet wewnątrzkomórkowych
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
DL-ditiotreitol (DDT)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D9779	Środki redukujące stosowane razem z papainą
NaOH	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S8045
Nifedypina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloker kanałów Ca2+ bramkowany napięciem typu L
Pływający stojak/uchwyt na rurki piankowe	Firma VWR Scientific	82017-634	Służy do trzymania probówek z enzymami do kontroli temperatury
Kwas glutaminowy (sól Na)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G1626	Ds
papaina	Korporacja Biochemiczna Worthington	LS003126	DS-P (Amerykański Inspektor ds-P)
MgCl2 (sześciowodny)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M2670	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
Kcl	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP366-1	Roztwór zewnątrzkomórkowy
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
Niemetalowa igła strzykawkowa, MicroFil	Wskaźnik WPI	MF-34G-5	Napełnianie roztworu pipet wewnątrzkomórkowych
Pipeta Pasteura	Marka rybacka	13-678-20A	Końcówki są odłamywane i polerowane ogniowo i używane do miareczkowania tkanek poddanych działaniu enzymatycznym w celu uwolnienia pojedynczych komórek DSM z kawałków
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375	Bufor pH
Łaźnia wodna z wytrząsaniem Thermo Scientific Precision (model 2870)	Thermo Scientific	Przerwać	Łaźnia wodna do kontroli temperatury trawienia enzymatycznego stosowana jako alternatywa dla kąpieli w komorze tkankowej
Rurki winylowe	ColePalmer	Numer katalogowy: 06405-3	Wiele zastosowań, w tym do łączenia kąpieli tkankowej z kąpielą z obiegową wodą
Wanna cyrkulacyjna wody, Haake D1 L	Haake powiedział:	Przerwać	Połączony z kąpielą tkankową
Mikroskop odwrócony ZeissAxiovert 40C z obiektywami 10x i 40x	Carl-Zeiss	Przerwać	Część zestawu z zaciskiem krosowym

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: