Analiza perforowanego zacisku krosowego za pośrednictwem amfoterycyny-B: elektrofizjologiczna technika badania prądów jonowych w komórkach pęcherza moczowego

Abstract

Źródło: Małysz, J. et al. Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich ludzkiego wypieracza do charakterystyki prądów kationowych wrażliwych na 9-fenantrol. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje charakterystykę prądów kationowych z kanałów jonowych melastatyny typu 4 (TRPM4) o potencjale przejściowym w komórkach mięśni gładkich detruzja za pośrednictwem amfoterycyny-B. Technika ta pomaga ocenić właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanałów jonowych.

Protocol

1. Rejestracja prądów kationowych indukowanych napięciem z ogniw DSM przy użyciu techniki perforowanego zacisku napięciowego całego ogniwa Amfoterycyna-B

1. Pobrać pipetę 0,25–1 ml zawiesiny komórek do komory ze szklanym dnem umieszczonej na stoliku mikroskopu odwróconego i pozwolić, aby komórki przylegały do szklanego dna.
2. Po inkubacji przez co najmniej 45 minut usunąć roztwór wytrawiający (DS) z kąpieli i zastąpić roztworem E (Tabela 1) przez superfuzję, gdzie przepływ roztworu wspomagany grawitacyjnie przez rurkę wlotową powoli zastępuje DS nowym roztworem, podczas gdy rurka wylotowa podłączona do próżniowego naczynia na odpady usuwa roztwór komory i zapobiega przepełnieniu.
   nuta: Roztwór E zawiera jony tetraetyloamonu (TEA⁺) i cezu (Cs⁺) w celu hamowania prądów K⁺.
3. Przygotować roboczy roztwór podstawowy amfoterycyny-B w dimetylosulfotlenku (DMSO) (1 mg na 10 μl DMSO). Aby całkowicie rozpuścić amfoterycynę w proszku, należy przeprowadzić sonikację (co najmniej 15 min) i dobrze zmieszać roztwór.
   nuta: Ten krok zajmuje zwykle mniej niż 10 minut. Dobrze sprawdza się rozpuszczenie 3–4 mg amfoterycyny-B w 30–40 μl DSMO w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Większe ilości amfoterycyny-B wymagają większej ilości rozpuszczalnika DSMO, co zwykle skutkuje dłuższym okresem mieszania i niepełnym rozpuszczeniem cząstek stałych amfoterycyny-B obecnych w probówce.
4. Rozpuścić roztwór podstawowy amfoterycyny-B w roztworze pipety (roztwór P, tabela 1) do uzyskania końcowego stężenia 200–500 μg/ml. Ten etap wymaga rozległej sonikacji i wirowania przy wysokim ustawieniu prędkości (8–10/10) przez ~30 do 60 minut na krok, aby zapewnić optymalne mieszanie i zapobiec tworzeniu się osadu amfoterycyny-B w roztworze pipety.
   nuta: Amfoterycyna-B wytrąca się z czasem i jest wrażliwa na światło. Roztwór roboczy do pipet zawierający amfoterycynę-B jest sprawdzany pod kątem rozpuszczalności, ręcznie mieszany przed napełnieniem pipety i przechowywany w ciemności.
5. Wyciągnij kilka elektrod łatkowych, wypoleruj końcówki elektrod i (jeśli to konieczne) pokryj końcówki woskiem dentystycznym.
6. Napełnić końcówkę elektrody z plastrem roztworem pipety (roztwór P, tabela 1) bez amfoterycyny-B, zanurzając elektrodę na krótko w roztworze.
7. Napełnij elektrodę tym samym roztworem pipety zawierającym amfoterycynę B.
8. Zamontuj elektrodę na uchwycie podłączonym do patch-clamp amplifier headstage.
9. Za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę tuż pod powierzchnią roztworu zewnątrzkomórkowego, tak aby końcówka elektrody była po prostu zanurzona.
10. W trybie cęgów napięcia ustaw potencjał podtrzymania na 0 mV i wyreguluj prąd na 0 pA za pomocą pokrętła przesunięcia pipety na komercyjnym wzmacniaczu (Tabela materiałów).
11. Określ rezystancję elektrody za pomocą okna/funkcji testu membrany w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (tabela materiałów). Aby aktywować, kliknij Narzędzia>Membrane Test>Play lub ikonę skrótu w oprogramowaniu. Wyznaczona rezystancja elektrody powinna mieścić się w zakresie od 2 do 5 MΩ,
    nuta: Funkcja testu membrany dostępna w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji lub opcja testu uszczelnienia we wzmacniaczu może być używana do monitorowania rezystancji elektrody poprzez powtarzalne stosowanie kroków napięcia.
12. Kontynuuj monitorowanie rezystancji elektrody, przesuwając elektrodę w kierunku wybranej komórki DSM za pomocą mikromanipulatora (Rysunek 1A).
    nuta: Aby można ją było uznać za żywotną komórkę DSM, komórka musi wykazywać wydłużoną morfologię w kształcie wrzeciona, dobrze zdefiniowaną aureolę wokół komórki, ostre krawędzie i półkurczliwy (serpentynowy) wygląd.
13. Po dotknięciu powierzchni ogniwa elektrodą - co wskazuje na szybki wzrost rezystancji elektrody mierzonej za pomocą funkcji testu membranowego - utwórz giga-uszczelnienie, przykładając delikatne szybkie podciśnienie do uchwytu elektrody za pomocą rurki. Powoduje to wytwarzanie podciśnienia na końcówce elektrody, które wciąga błonę komórkową do elektrody, pomagając w tworzeniu giga-seal lub bardzo ścisłego kontaktu między elektrodą a błoną plazmatyczną (rysunek 1B).
14. Po uformowaniu się giga-seal skompensuj pojemność pipety, regulując szybkie i wolne pokrętła na komercyjnym wzmacniaczu i monitoruj stabilność giga-seal (prąd wycieku) za pomocą funkcji Membrane Test.
15. Odczekaj czas, zwykle 30–60 minut, aby amfoterycyna-B dyfundowała w dół pipety i została wprowadzona do błony plazmatycznej, tworząc pory głównie selektywne dla kationów jednowartościowych. Na tym etapie kontynuuj monitorowanie giga-seal za pomocą funkcji Membrane Test. Wraz ze wzrostem perforacji komórki zwiększa się amplituda stanów przejściowych pojemności (porównaj rysunek 1B z rysunkiem 1C, na którym przedstawiono odpowiednio brak i efektywną perforację komórki) mierzoną za pomocą funkcji testu membranowego.
16. Gdy perforacja łaty jest optymalna (oceniana na podstawie stabilnej rezystancji szeregowej, zwykle poniżej 50 MΩ), zlikwiduj stany nieustalone pojemności, regulując pokrętła pojemności ogniwa i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu. W tym czasie można również przeprowadzić kompensację rezystancji szeregowej (rysunek 1D).
17. Po zaobserwowaniu stabilnych prądów kationowych indukowanych krokowo napięciem wywołanych przez określony protokół, należy zastosować stan złożony lub fizjologiczny do przetestowania przez superfuzję i zapisać odpowiedzi dla warunków kontrolnych, testowych i wymywania (jeśli to możliwe) za pomocą komercyjnego oprogramowania do akwizycji.
    1. Rejestruj prądy za pomocą rutynowego protokołu krokowego napięcia, który polega na utrzymywaniu ogniw DSM na poziomie -64 lub -74 mV i stopniowaniu napięcia w krokach co 10 mV przez 400 lub 500 ms od -94 do +96 lub +106 mV i powrocie do potencjału podtrzymania.
       nuta: Wartości potencjału membranowego są dostosowywane do potencjału złącza cieczy wynoszącego 14 mV (przy użyciu roztworów P i E, tabela 1). Potencjał złącza cieczy uzyskuje się w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (Tabela materiałów) poprzez kliknięcie Narzędzia>Potencjały złączy i wprowadzenie stężeń składników jonów roztworu. Protokół ramp może być również wykorzystany do uzyskania bieżących nagrań.
    2. Uruchom protokół napięcia w ciągłym interwale ~ 1 min podczas eksperymentu, rejestrując prądy w celu kontroli przed dodawaniem, warunków testowych i wymywania

Typ rozwiązania	Skład (w mM)
DS (roztwór do rozwarstwiania/trawienia)	80 Na-glutaminian, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 i 11 glukozy, pH dostosowane do 7,4 (z 10 M NaOH)
DS-P (DS zawierający papainę)	DS zawierające 1–2 mg/ml papainy, 1 mg/ml ditiotreitolu i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej
DS-C (DS zawierający kolagenazę)	Roztwór DS zawierający 1–2 mg/ml kolagenazy typu II, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0 lub 1 mg/ml inhibitora trypsyny i 100-200 μM Ca2+
P (Pipeta)	110 CsOH, 110 kwas asparaginowy, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA i 30 CsCl, pH dostosowane do 7,2 z CsOH i uzupełnione amfoterycyną-B (300-500 μg / ml)
E (Pozakomórkowy)	10 chlorek tetraetyloamoniowy (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES i 10 glukozy, pH dostosowane do 7,3–7,4 z NaOH lub CsOH i 0,002–3 (2–3 mM) nifedypina

Tabela 1: Skład roztworu do rozwarstwiania/trawienia (DS) oraz roztworów pipetowych i zewnątrzkomórkowych stosowanych w eksperymentach z perforowanymi zaciskami krosowymi.

Results

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja etapów związanych z tworzeniem giga-seal i perforacją amfoterycyny-B w ludzkich komórkach DSM. Przedstawiono pozycje przestrzenne pipety zawierającej amfoterycynę-B i celi DSM wraz z powiązanymi odpowiedziami na testy membranowe uzyskanymi w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (tabela materiałów) poprzez zmianę kroków napięcia ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ml polistyrenowej rurki okrągłodennej	sokół	352054	Probówki do DS zawierające enzymy stosowane na etapach trawienia
Amfoterycyna-B	rybak	Zobacz materiał BP928-250	Służy do perforacji łat/komórek
Amfoterycyna-B	Normy referencyjne Farmakopei Europejskiej	5	Służy do perforacji łat/komórek
Amfoterycyna-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Służy do perforacji łat/komórek
Analogowy mikser wirowy	Firma VWR	Nr kat. 58816-121
kwas asparaginowy	Sigma-Aldrich	A9006	Roztwór do pipet wewnątrzkomórkowych
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1016	Roztwór zewnątrzkomórkowy i DS
Szkło kapilarne	Sutter	Zobacz materiał BF150-110-7.5	Kapilara do przygotowania elektrod ciągniętych
Hydrat wodorotlenku cezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8518	Roztwór do pipet wewnątrzkomórkowych
Oprogramowanie Clampex ver. 10 zawiera programy do pozyskiwania danych (Clampex) i analizy (Clampfit)	Instrumenty Axon/ Urządzenia molekularne	pCLAMP-10	Oprogramowanie komercyjne i część konfiguracji platformy z zaciskiem krosowym
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
Wosk dentystyczny	Miltex Dental Wax Technologies, Inc.	18058351
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D2650	rozpuszczalnik
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889	Chelator Ca2+, stosowany w wewnątrzkomórkowym roztworze pipet
Ściągacz do mikropipet płomieniowy/brązowy	Sutter	Zobacz materiał P-97	Wymagane do wyciągania elektrod z bardzo cienkimi końcówkami
Pływający stojak/uchwyt na rurki piankowe	Firma VWR Scientific	82017-634	Służy do trzymania probówek z enzymami do kontroli temperatury
glukoza	Sigma	Kontroler G8270
Kwas glutaminowy (sól Na)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G1626	Ds
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375	Bufor pH
Kcl	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP366-1	Roztwór zewnątrzkomórkowy
System akwizycji danych o niskim poziomie szumów	Instrumenty Axon/ Urządzenia molekularne	Digidata 1440A	Część zestawu z zaciskiem krosowym
Mieszadło magnetyczne	Firma VWR	Numer katalogowy: 01-442-684
MgCl2 (sześciowodny)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M2670	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
Mikrokuźnia	Narishige powiedział:	MF-830	Służy do elektrod do polerowania ogniowego
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653	Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
NaOH	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S8045
Nifedypina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloker kanałów Ca2+ bramkowany napięciem typu L
Mikroskop odwrócony firmy Nikon, TS100 ze stolikiem T1-SM z obiektywami 5x, 10x, 20x i 40x	Nikon	Przerwać	Część konfiguracji zestawu Patch-clamp
Niemetalowa igła strzykawkowa, MicroFil	Wskaźnik WPI	MF-34G-5	Napełnianie roztworu pipet wewnątrzkomórkowych
Pipeta Pasteura	Marka rybacka	13-678-20A	Końcówki są odłamywane i polerowane ogniowo i używane do miareczkowania tkanek poddanych działaniu enzymatycznym w celu uwolnienia pojedynczych komórek DSM z kawałków
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Instrumenty Axon/ Urządzenia molekularne	Axon Axopatch 200B	Część zestawu z zaciskiem krosowym
Komputer PC	dolina	Konfiguracja niestandardowa	Część zestawu z zaciskiem krosowym
pH-metr	Instrumenty Aspera	PH700
Rurki z polietylenu	Lekarz	Rozdział 427-436	Rurka do superfuzji kąpieli zewnątrzkomórkowej podłączona do komory zapisu ze szklanym dnem
Chlorek tetraetyloamonu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T2265	Bloker kanałów jonowych Kv i BK dodany do roztworu kąpieli zewnątrzkomórkowej
Skala ważenia	METTLER TOLEDO	Zobacz materiał XS64
Mikroskop odwrócony ZeissAxiovert 40C z obiektywami 10x i 40x	Carl-Zeiss	Przerwać	Część zestawu z zaciskiem krosowym