Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Nieleczone, zdrowe myszy typu dzikiego (WT) (n = 4) i myszy cd44-/- (n = 4) zostały uśmiercone w wieku 12−16 tygodni. Wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy. Wszystkie myszy znajdowały się na tle C57Bl/6.
1. Wycięcie nerki myszy
- Poświęć zdrowe myszy WT lub myszy zmodyfikowane genetycznie przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Wypreparuj całe nerki myszy bezpośrednio po złożeniu myszy w ofierze. W tym celu wykonaj laparotomię pośrodkową za pomocą nożyczek brzusznych, przecinając skórę, a następnie mięśnie brzucha. Usuń jelito i umieść je obok myszy.
- Uwolnij nerki z tkanki łączącej i wyciągnij nerkę za pomocą kleszczy chirurgicznych, przecinając nożyczkami tętnicę nerkową, żyłę nerkową i moczowód
.
- Usuń kapsułki nerkowe z nerek, przytrzymując nerkę kleszczami chirurgicznymi i zdejmij kapsułkę za pomocą innej pary kleszczy.
- Umieść nerki na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (2 nerki/dołek) przygotowanej z 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na dołek i umieść na lodzie.
2. Izolacja kłębuszków nerkowych od nerki myszy
- Przenieś nerki na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i zmiel nerki na małe kawałki o wielkości 1-2 mm za pomocą dwóch skalpeli. Utrzymuj zmielone kawałki nerki w stanie mokrym, używając 1-2 ml HBSS.
- Umieścić zmielone kawałki nerki na metalowym sicie o grubości 300 μm i przecisnąć nerkę przez sito za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 20 ml. Kilkakrotnie przepłukać sito HBSS pomiędzy nimi i zebrać przepływ na czystą płytkę Petriego za pomocą pipety serologicznej. Zebrać również wszystko, co pozostało/przykleiło się do dolnej strony sita, zeskrobując je skalpelem i przenieść do zebranego przepływu (homogenatu nerkowego).
- Przepłukać homogenat nerkowy przez sito o wielkości 75 μm za pomocą HBSS. Zebrać przepływ, a następnie przepłukać go przez sito o średnicy 53 μm. Umyj oba sita za pomocą HBSS, aby usunąć wszystkie mniejsze struktury.
nuta: Na tym etapie przepływ jest tylko płukany, ale nie przetłaczany przez sito 75 μm i 53 μm. Mycie HBSS jest konieczne do usunięcia zanieczyszczeń i mniejszych struktur na sitach. Dlatego zwykle w sumie zużywa się 200-300 ml HBSS.
- Zbierz struktury/materiał nerkowy, które pozostały na sicie 75 μm i 53 μm, myjąc górną powierzchnię sit zmodyfikowanym podłożem Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 20% płodową surowicą cielęcą (FCS) i przenieś materiał do 6-dołkowej mikropłytki o bardzo niskim przyłączeniu.
nuta: Aby umyć górną powierzchnię sita, należy przepłukać sitko w pozycji pochylonej (>45°) i zebrać materiał nerkowy na krawędzi sita. Pobrany materiał wzbogacony jest zarówno o kłębuszki otorbione, jak i dekapsulowane, ukazując jedynie kilka fragmentów rurkowych. Kłębuszki otorbione są bardzo lepkie. Aby zebrać pojedyncze kłębuszki nerkowe, ważne jest zatem, aby zapobiec przywieraniu kłębuszków do powierzchni szalki Petriego lub płytki studzienki. Aby uniknąć przywierania, użyj podłoża z 20% FCS i użyj na tym etapie płytek mocujących o bardzo niskim poziomie.
3. Hodowla kłębuszków nerkowych
- Przynieś mikropłytkę o bardzo niskim nasadce do mikroskopu światła odwróconego i zbierz pojedyncze kłębuszki nerkowe w kapsułkach i/lub pozbawione kapsułki za pomocą pipety o pojemności 20 μl. Unikaj pipetowania innych struktur i zanieczyszczeń. Po pobraniu pojedynczego kłębuszka nerkowego do końcówki pipety dodać świeże podłoże DMEM bez zebranego materiału nerkowego do tej samej końcówki pipety w objętości 20 μl.
- Przenieść pojedyncze kłębuszki nerkowe z 20 μl pożywki DMEM do środka studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% (v/v) CO2 , aby umożliwić przyłączenie kłębuszków nerkowych do środka studzienki. Ostrożnie przesuń płytkę, aby uniknąć unoszenia się kłębuszków nerkowych do granic studni.
- Po 3 godzinach inkubacji kłębuszek nerkowy jest przymocowany do środka studni. Ostrożnie dodaj 500 μl śródbłonkowego podłoża podstawowego (EBM) uzupełnionego zestawem czynników wzrostu zawierających hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu śródbłonka, ekstrakt z mózgu bydlęcego i siarczan gentamycyny-amfoterycynę B (tabela materiałów) i dodatkowe 5% (v/v) FBS i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (długopis/paciorkowiec) do każdej studzienki.
- Hodować pojedyncze kłębuszki nerkowe przez 6 dni w temperaturze 37 °C, 5% (v/v) CO2,
UWAGA: W ciągu 6 dni powstaje wyrostek składający się z komórek nabłonka ciemieniowego. Jeśli ktoś ma na celu przetestowanie wpływu określonych związków lub leków na komórki nabłonka okładziny, powinien on zostać dodany do pożywki w ciągu tych 6 dni.
