$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wszczepienie guza
UWAGA: Każdej myszy wszczepia się 1 x 10 komórek5 MB49-PSA w 50 μL ślepej pożywki DMEM w pęcherzu moczowym. Ze względu na martwą przestrzeń w cewniku, zawsze przygotuj dodatkową objętość (co najmniej 100 μl więcej na mysz). Alternatywnym podejściem byłoby użycie strzykawki wypełnionej powietrzem.
- Komórek
- Na dzień przed implantacją, gdy komórki są w około 80% zlewne, należy przejść komórki nowotworowe MB49-PSA w kompletnym pożywce DMEM (uzupełnionej 10% FBS, 2 mmol/L L-glutaminą, 0,05 mg/ml penicyliny-streptomycyny i 200 μg/ml higromycyny B) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w stosunku podziału 1:2.
- W dniu zabiegu należy pobrać komórki, delikatnie je zeskrobując sterylnym skrobakiem do komórek. Zmieszać równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% roztwór błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Nie należy wszczepiać implantu, jeśli więcej niż 20% komórek jest martwych.
- Oblicz wymaganą liczbę żywych komórek (2 x 10,6 komórek/ml) i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórek w ślepej pożywce DMEM. Powtórz mycie trzy razy, aby usunąć wszelkie ślady FBS przed implantacją.
- Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie, aż myszy będą gotowe do implantacji.
- Pozwól 4- do 6-tygodniowym samicom myszy C57BL/6J zaaklimatyzować się przez tydzień przed zabiegiem. Wszystkie prace na zwierzętach muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki.
- Zważyć każdą mysz i wstrzyknąć znieczulenie (75 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg medetomidyny) dootrzewnowo w ilości 0,1 ml na 10 g masy ciała. Masa ciała powinna wynosić od 17 do 22 g. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji po uszczypnięciu palca u nogi.
- W celu identyfikacji oznacz ucho za pomocą dziurkacza do uszu.
- Roztwór Hartmanna lub związek mleczanu sodu należy wstrzykiwać dootrzewnowo w ilości 0,1 ml na 10 g masy ciała co 1–2 godziny w celu nawodnienia.
- Nałóż sterylną maść okulistyczną na oba oczy za pomocą sterylnej bawełnianej bawełnianej bawełny, ponieważ odruch mrugania zostaje utracony w znieczuleniu, a oczy wysychają. W razie potrzeby zastosuj ponownie.
- Połóż myszy w pozycji leżącej na plecach na ręcznikach papierowych na wierzchu okładu grzewczego (aktywowanego przez kontakt z powietrzem), aby utrzymać temperaturę ciała i przyklej tylne nogi taśmą.
- Delikatnie uciskaj palcem dolną część brzucha i zbieraj mocz z pęcherza moczowego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ta próbka służy jako podstawowa wartość PSA w moczu.
- Pobrać sterylną poli-L-lizynę (PLL) do strzykawki o pojemności 1 ml i założyć cewnik dożylny o rozmiarze 24 z usuniętym trzonkiem igły. Nałóż lubrykant na końcówkę cewnika i wprowadź cewnik przez cewkę moczową do pęcherza moczowego za pomocą kleszczy do prowadzenia cewnikowania. Zatrzymaj się, gdy wyczujesz opór.
UWAGA: Badacze powinni omówić ze swoim personelem weterynaryjnym potrzebę stosowania żelu nawilżającego ze środkiem znieczulającym do wkraplania dopęcherzowego oraz stosowania pozabiegowych leków przeciwbólowych.
- Wkraplaj 50 μL PLL powoli, w tempie 10 μL co 20 sekund, aby uniknąć refluksu pęcherzowo-moczowodowego. Pozostaw cewnik w pęcherzu moczowym na 20 minut z korkiem, aby zapobiec wyciekowi.
- Po 20 minutach wyjmij cewnik i opróżnij pęcherz z całej zawartości, delikatnie naciskając dolną część brzucha. Za pomocą pustej strzykawki o pojemności 1 ml wypłukać pozostałą zawartość z cewnika.
- Dokładnie wymieszać komórki MB49-PSA przez pipetowanie i pobrać je do strzykawki o pojemności 1 ml. Załóż cewnik i nałóż lubrykant. Wkraplanie 50 μl z 1 x 105 komórek w wolnym tempie 10 μl co 20 s. Wymienić korek na cewniku. Podaj myszom kontrolnym 50 μl soli fizjologicznej.
- Po 1 godzinie wyjmij cewniki i opróżnij pęcherz z wszelkiej zawartości. Usuń taśmę z tylnych nóg i umieść myszy na ich brzusznych stronach. Oceń myszy, wstrzykując podskórnie lek odwracający działanie (1 mg/kg atipamezolu) w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.
- Monitoruj myszy, aż zaobserwuje się ruchliwość. Wróć myszy do ich klatek.