Przygotowanie bloków sferoidalnych raka przez błyskawiczne zamrażanie: procedura zachowania sferoid raka w zamrożonych blokach matrycy

Streszczenie

Źródło: Wang, Y. et al. 3-D System hodowli komórek do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje przygotowanie bloków sferoidalnych raka poprzez błyskawiczne zamrażanie, technikę, w której próbka tkanki będąca przedmiotem zainteresowania jest zamrażana do ultraniskiej temperatury, ograniczając sferoidy wewnątrz matrycy.

Protokół

1. Przygotowanie bloku próbki zawierającego sferoidy nowotworowe do cięcia zamrożonych tkanek

1. Ostrożnie podnieś blok żelu kolagenowego i sferoidy ze szkiełek komory za pomocą małych kleszczyków. Umieść blok żelu kolagenowego w plastikowej formie histologicznej.
2. Krótko spłucz żel kolagenowy 1x PBS, a następnie utrwal go 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: PFA jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
3. Myj żel kolagenowy 1,5 ml 1x PBS na shakerze przez 15 min. Wymień PBS i powtórz poprzedni krok mycia 3x.
4. Nałóż cienką warstwę (około 3 mm) mieszanki o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby pokryć spód nowej plastikowej formy histologicznej. Umieść utrwalony i umyty żel kolagenowy na wierzchu związku OCT, a następnie ostrożnie zanurz cały żel, wypełniając formę związkiem OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza w OCT.
5. Pozostaw formę w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
6. Umieścić formę zawierającą próbkę i związek OCT na 100-milimetrowej szalce Petriego unoszącej się na ciekłym azocie. Pozostawić próbkę do całkowitego zamrożenia.
7. Zamrożony blok próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka do hodowli komórkowych DMEM	Thermo Fisher Naukowy	11995065
Surowica bydlęca płodu	Thermo Fisher Naukowy	26140079
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100x)	Thermo Fisher Naukowy	15240062
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	Samolot A3803
Solanka buforowana fosforanami (PBS), Odczyn pH 7,4	Thermo Fisher Naukowy	10010023
Kolagen typu 1 z ogona szczura, wysoki koncentracja	Corning	354249
Nunc Lab-Tek II Komorowy Szkło nakrywkowe	Thermo Fisher Naukowy	155382
Roztwór paraformaldehydu	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 15710
Związek OCT	Thermo Fisher Naukowy	23730571