Izolacja egzosomów: technika ultrawirowania oparta na gęstości wykorzystująca poduszkę sacharozy do oddzielania egzosomów od kondycjonowanych pożywek hodowanych komórek

Streszczenie

Źródło: Faruqu, F. N. et al. Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek rakowych.J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę ultrawirowania opartą na gęstości do izolowania egzosomów z kondycjonowanych pożywek pobranych z ludzkich embrionalnych hodowli komórek nerkowych przy użyciu 25% (w/w) poduszki sacharozowej przygotowanej w tlenku deuteru. Wyizolowane egzosomy mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań.

Protokół

1. Izolacja egzosomu na poduszce z sacharozy

1. Wstępnie oczyścić zebrane kondycjonowane podłoże (CM) przez różnicowe wirowanie i filtrację w następujący sposób.
   1. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić osad. Powtórzyć ten etap wirowania jeszcze raz, odzyskując supernatant i odrzucając osad.
   2. Odwirować supernatant z etapu 1.1 przy 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić osad. Odzyskany supernatant przefiltrować raz przez filtry 0,22 μm.
2. Podczas wstępnego oczyszczania przygotować 25% (w/w) roztwór sacharozy w tlenku deuteru, dokładnie odważając 1,9 g (± 0,001 g) sacharozy w probówce uniwersalnej, a następnie uzupełniając tlenkiem deuteru, aż masa osiągnie 7,6 g (± 0,001 g).
3. Napełnij probówkę ultrawirówki (patrz tabela materiałów) 22,5 ml wstępnie oczyszczonego CM. Uzupełnij CM do 22,5 ml za pomocą 0,22 μm przefiltrowanego PBS, jeśli bieżąca objętość jest mniejsza.
4. Umieścić szklaną pipetę (patrz Tabela Materiałów) w probówce i przez nią dodać 3 ml roztworu sacharozy, tak aby roztwór utworzył oddzielną warstwę pod CM.
5. Ostrożnie umieścić probówkę zawierającą warstwowy roztwór CM/sacharozy w wiadrze odchylanego wirnika (patrz Tabela materiałów) i przymocować wiadro do wirnika.
6. Umieścić rotor w ultrawirówce (patrz tabela materiałów) i wirować z prędkością 100 000 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Zebrać 2 ml warstwy sacharozy i dodać ją do butelki ultrawirówki (patrz tabela materiałów) zawierającej 20 ml przefiltrowanego PBS do etapu płukania.
8. Umieść rurki w wirniku o stałym kącie nachylenia (patrz tabela materiałów) i wiruj z prędkością 100 000 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4°C.
9. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić osad z 400 μl przefiltrowanego PBS. Przechowuj ten zapas egzosomu w temperaturze 4 °C lub -80 °C odpowiednio do krótkotrwałego i długoterminowego przechowywania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sacharoza	Fisher Naukowy	Nr kat. S/8600/60	1 kg
Tlenek deuteru (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 gramów
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Thermo Fisher Naukowy	10010015	Pojemność 500 ml
Filtr strzykawkowy Millex-GP 0,22 μm	Milipory	SLGP033RS
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Odchylany wirnik	Beckman Coulter	Zobacz materiał SW45 Ti
Wirnik o stałym kącie nachylenia	Beckman Coulter	Typ 70 Ti
Probówki ultrawirówkowe	Beckman Coulter	355631	Poliwęglan. Max. wypełnienie 32 ml
Butelki do ultrawirówek	Beckman Coulter	355618	Poliwęglan. Min. napełnienie 16 ml, maksimum napełnienie 25 ml
wirówka	Eppendorf	Zobacz materiał 5810R
Pipety szklane	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1156-6963
25% w/w poduszka sacharozy			Dodać 1,9 g (± 0,001 g) sacharozy w probówce uniwersalnej i uzupełnić D2O, aż masa osiągnie 7,6 g (± 0,001 g). To daje ~ 6 ml poduszki sacharozowej o zawartości 25% w/w.