Enkapsulacja siRNA do egzosomów za pomocą elektroporacji: technika oparta na impulsach elektrycznych do ładowania siRNA do egzosomów

Streszczenie

Źródło: Faruqu, F. N. et al. Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje metodę opartą na elektroporacji do enkapsulacji siRNA do egzosomów. Egzosomy załadowane siRNA mogą być następnie wykorzystywane do zastosowań terapeutycznych.

Protokół

1. Enkapsulacja siRNA do egzosomów za pomocą elektroporacji

1. Wstępnie schłodzić kuwetę do elektroporacji (patrz tabela materiałów) na lodzie przez 30 minut przed elektroporacją.
2. Wymieszaj 7,0 μg egzosomów (32 μl z 7 x 10¹² p/ml zapasu w PBS) z 0,33 μg siRNA (12 μL z 2 μM zapasu w wodzie wolnej od RNaz) w probówce mikrowirówkowej. Uzupełnić objętość do 150 μl buforem kwasu cytrynowego (patrz tabela materiałów). Stosunek molowy egzosomu do siRNA wynosi w tym przypadku 1:60.
3. Przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji. Zakręć kuwetę i umieść ją w uchwycie kuwety elektroporatora (patrz Tabela materiałów). Obróć pokrętło obrotowe o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
   nuta: Koło musi być całkowicie obrócone do pozycji zablokowanej, aby kuweta zetknęła się z elektrodami.
4. Wybierz żądany program elektroporacji (np. X-01, X-05, A-20, T-20, T-30 itd.) i rozpocznij elektroporację, naciskając przycisk start.
   nuta: Pomyślny impuls jest sygnalizowany wyświetleniem "OK" na wyświetlaczu.
5. Po elektroporowaniu wyjmij kuwetę po obróceniu koła o 180° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Pobrać próbkę z kuwety za pomocą plastikowej pipety w celu dalszego przetwarzania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(Oznakowane-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (Bez oznaczenia) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Pipety szklane	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 1156-6963
Amaxa Nucleofector I	Lonza	Jądro Jądro I	Z zestawami Nucleofector firmy Amaxa
Bufor kwasu cytrynowego z EDTA			Wymieszaj 0,1954 g kwasu cytrynowego i 0,2087 g fosforanu disodowego w 50 ml wody dejonizowanej. Dodaj EDTA do 0,1 mM. Dostosuj pH do 4,4.
Rurki do mikrofuge	Starlab (Laboratorium Starlab)	S1615-5500	Pojemność 1,5 ml

powiedział: