$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych komórek kanalików
- Wyjąć torebki nerkowe i rdzeń, zmielić obie nerki na drobne kawałki i inkubować je w 10 ml buforu wytrawiającego w suszarce o temperaturze 37 °C, delikatnie obracając przez 5 minut.
- Usunąć wszelkie niestrawione tkanki nerkowe, przepuszczając bufor przez filtr 70 μm. Dodaj 10 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać trawienie.
- Aby zebrać komórki rurkowe, należy odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 5 minut, aby zebrać pierwsze osady. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać 5 ml pożywki hodowlanej, odwirować ją przy 50 x g przez 5 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki rurkowe zostały zebrane do drugiej osadki. Wirowanie odbywa się z mniejszą prędkością, aby przede wszystkim granulować ciężkie rurki. Później, po tym, jak komórki odzyskają siły po izolacji, czysta kultura rurkowa jest odwirowywana z większą prędkością podczas subkultur.
- Ponownie zawiesić pierwszy osad w 20 ml pożywki hodowlanej i odwirować go przy 50 x g przez 5 minut, aby zebrać trzeci osad.
- Zawiesić drugie i trzecie osadki w 1 ml pożywki hodowlanej. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego, załadować mieszaninę do komory A na szkiełku zliczającym i zapisać żywotność komórek z automatycznego licznika komórek.
- Wysiewaj do 107 komórek (niejednorodna populacja) na pojedynczym 60 mm naczyniu wstępnie pokrytym kolagenem i pozwól komórkom rurkowym przyczepić się przez noc.