Barwienie kwasem okresowym Schiffa lub PAS: metoda oceny deformacji strukturalnych kłębuszków nerkowych

1. Plama Schiffa spowodowana kwasem okresowym (PAS)

UWAGA: Plama PAS uwydatni błony podstawne pętli kapilarnych kłębuszków nerkowych i nabłonek rurkowy. Umożliwia szczegółową wizualizację komórek kłębuszków nerkowych, macierzy mezangialnej i ekspansji potencjału oraz potencjalnych zmian GBM (tj. zgrubień i nierówności).

1. Przeciąć zatopioną w parafinie, utrwaloną w PFA korę nerkową za pomocą mikrotomu o grubości 5 μm na szkiełka pokryte poli-L-lizyną. Suszyć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Upewnij się, że sekcja nie zawiera żadnych fałd ani otworów, które mogą zniekształcić morfologię pod mikroskopem.
2. Deparafinizować szkiełka poprzez dwukrotną inkubację w ksylenie (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorium) przez 3 minuty każde, dwa razy w 100% EtOH przez 3 minuty każde, a następnie raz w 95%, 70% i 50% EtOH przez 3 minuty każde, wszystko w temperaturze pokojowej. Nawodnić szkiełka w dH₂O.
3. Inkubować szkiełka w roztworze kwasu okresowego (UWAGA, drażniący; stosować w dygestorium) (1 g/dl) przez 5 minut, a następnie płukać szkiełka w kilku zmianach_dH2O. Użyć pojemnika ze 100 ml_dH2O w temperaturze pokojowej.
4. Inkubować szkiełka w odczynniku Schiffa (chlorowodorek parasoaniliny 6 g/l i pirosiarczyn sodu 4% w HCl 0,25 mol/l) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
5. Przeciwbarwienie hematoksyliną przez 3 sekundy przed dokładnym spłukaniem szkiełek pod bieżącą wodą z kranu przez 15 min.
   nuta: Może być wymagana pewna optymalizacja w celu określenia optymalnego czasu barwienia hematoksyliny.
6. Odwadnianie szkiełek przy użyciu odwrotnego protokołu deparafinowania. Na koniec posyp ksylenem.
7. Suche na powietrzu prowadnice i montaż za pomocą nośników montażowych na bazie ksylenu.
8. Obraz pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 400x w celu oceny struktur kłębuszkowych. Oceń następujące elementy: pogrubienie i nieprawidłowości GBM, zapadanie się pętli naczyń włosowatych, tkanka zwłóknieniowa, stwardnienie rozsiane, proliferacja komórkowa (śródbłonek, podocyty i mezangia lub komórki zapalne naciekające kępkę).
   nuta: W celu kompleksowej oceny patofizjologii kłębuszków nerkowych należy ocenić zmiany chorobowe w innych częściach nerek, np. w kanalikach.