Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wykonaj operację hydrodynamicznego wstrzykiwania miednicy nerkowej
- Ostrożnie wybieraj myszy do operacji.
UWAGA: Różnice specyficzne dla szczepu nie zostały jeszcze zaobserwowane, ale mogą być możliwe. Większość wstrzyknięć została wykonana na tłach C57BL/6 lub FVB. Iniekcje do miedniczki nerkowej działają najlepiej u myszy w wieku 6–12 tygodni. U myszy trwających dłużej niż 16 tygodni możliwy jest do 50% odsetek niepowodzeń obrazowania lucyferazy z niejasnych przyczyn. Ten sam odsetek niepowodzeń związanych z wiekiem zaobserwowano w przypadku hydrodynamicznych iniekcji do wątroby przez żyły ogonowe, więc może to być ogólne ograniczenie odnoszące się do zasady iniekcji hydrodynamicznej. W ten sam sposób inni wykazali, że hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej do zwłókniejącej wątroby szczura nie jest tak skuteczne, jak zdrowa wątroba, więc może być możliwe, że w warunkach zwłóknienia nerek hydrodynamiczne wstrzyknięcie miedniczki nerkowej nie będzie tak skuteczne, ale nie zostało to bezpośrednio przetestowane.
2. Przygotowanie myszy i strzykawek DNA do operacji
- Znieczulij myszy ketaminą i ksylazyną.
- Załóż odpowiednie środki ochrony osobistej wymagane przez obiekt dla zwierząt, takie jak jednorazowy fartuch laboratoryjny, chirurgiczna maska na twarz i rękawice nitrylowe.
- Pracując z 2-4 myszami jednocześnie, zważ każdą mysz w plastikowej zlewce o pojemności 500 ml na skali o dokładności do 0,1 g. Oblicz prawidłową ilość 24 mg/ml ketaminy i 2 mg/ml ksylazyny rozcieńczonej w normalnym 0,9% roztworze soli fizjologicznej, aby podać ją każdej myszy we wstrzyknięciu dootrzewnowym (zobacz film referencyjny, aby uzyskać więcej informacji na temat wstrzyknięcia dootrzewnowego). Użyj wzoru (50 μL + ((5 μL) x (waga(g))) lub alternatywnie oblicz według innego wzoru po konsultacji z lokalnym zespołem lekarzy weterynarii i IACUC.
- Wstrzyknąć mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe standardowymi technikami. Umieść mysz w papierowym wiadrze, aż mysz będzie nieruchoma.
UWAGA: Myszy są gotowe do operacji, gdy nie reagują już na test szczypania palców u stóp. Myszy z bólem palca u nogi należy podać 20–30 minut po pierwszym wstrzyknięciu 20–60 μl więcej środka znieczulającego, w zależności od siły odpowiedzi.
- Umieść mysz na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody pokrytej niebieską podkładką i umieść maść weterynaryjną w obu oczach, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Ogol lewą stronę grzbietu myszy od ramienia do zadu i od boku do kręgosłupa za pomocą golarki przeznaczonej do pielęgnacji zwierząt domowych. Usuń luźne włosy i zanieczyszczenia.
- Przygotuj osobną strzykawkę zawierającą 100 μl rozcieńczonego DNA dla każdej znieczulonej myszy, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
- Użyj sterylnej strzykawki insulinowej 29G x 1/2" 0,5 ml U-100 z igłą przymocowaną na stałe bez zabezpieczenia.
UWAGA: Typ strzykawki ma kluczowe znaczenie. Ten manometr pozwala na szybkie wstrzyknięcie. Przymocowana na stałe igła zapobiega wyciekaniu roztworu. Obecność bezpieczeństwa utrudni dostęp do miedniczki nerkowej. Strzykawki określone w tabeli materiałów ślizgają się bardziej równomiernie podczas wstrzykiwania niż inne testowane marki.
- Załadować strzykawkę do ~120 μl i pociągnąć tłok w dół, aby utworzyć wolne miejsce u góry. Stukaj długopisem, aż wszystkie pęcherzyki powietrza uniosą się do góry. Trzymając igłę do góry, ostrożnie wcisnąć tłok, aby usunąć całe powietrze, aż na końcu igły utworzy się kropla. Nie powinno być żadnych widocznych pęcherzyków, ponieważ mogą one spowodować zator powietrzny, który zabije zwierzę.
- Zakończyć wciskanie tłoka, aż w strzykawce znajdzie się 100 μl, opróżniając nadmiar roztworu DNA do oryginalnej probówki do mikrofugi. W razie potrzeby ostrożnie oznaczyć i umieścić załadowane strzykawki na sterylnej serwety, aby zachować sterylność, jeśli obiekt, w którym wykonywana jest praca, nie pozwala na ponowne nakręcenie igieł.
3. Wykonaj operację iniekcji
- Przygotuj miejsce do zabiegu. Umieść sterylną serwetkę na poduszce grzewczej i opróżnij sterylne narzędzia chirurgiczne na sterylnej serwetce, nie dotykając ich. Podnieś mysz i umieść ją w polu view. Dostosuj oświetlenie, aby oświetlić obszar.
- Wyjmij z opakowań trzy 3,15% glukonianu chlorheksydyny i 70% antyseptyczne waciki antyseptyczne do skóry z alkoholem izopropylowym i umieść w pobliżu zwierzęcia.
- Przebierz się w sterylne rękawiczki chirurgiczne. Pracując okrężnymi ruchami, zaczynając od miejsca nacięcia, trzykrotnie przetrzyj zwierzę nowym wacikiem z chlorheksydyną/alkoholem.
- Zlokalizuj miejsce nacięcia, jak pokazano na rysunku 1A. Szczypiąc skórę pęsetą, za pomocą nożyczek wykonaj cięcie warstwy skóry około 1 cm od kręgosłupa i poniżej klatki piersiowej. Gdy miejsce cięcia ma około 1 cm długości, wykonaj podobne miejsce cięcia poniżej, w warstwie mięśni.
UWAGA: Wykonaj nacięcie o odpowiedniej długości, aby nerka ledwo przeszła przez nacięcie, a następnie została utrzymana na miejscu przez samo nacięcie. Zbyt małe nacięcie i nerka nie może być odsłonięta; zbyt duży, a nerka będzie stale wślizgiwać się z powrotem do jamy brzusznej.
- Zlokalizuj nerkę.
nuta: Może być widoczny wśród białej tkanki tłuszczowej. Śledziona znajduje się również po lewej stronie zwierzęcia. Kolor tych narządów można wizualnie zróżnicować, ponieważ śledziona jest ciemnobordowa, podczas gdy nerka jest ciemnoczerwono-pomarańczowa. Nie jest pożądane manipulowanie śledzioną, ponieważ można ją łatwo pęknąć.
- Nie dotykając nerki, delikatnie odsłoń ją od jamy brzusznej, wywierając stały, delikatny nacisk palcami na brzuch (ryc. 2C). Użyj zamkniętej pęsety, aby w razie potrzeby delikatnie wepchnąć niepożądane narządy z powrotem do jamy brzusznej. Nie używaj otwartych kleszczy, ponieważ może to uszkodzić nerki lub inne narządy.
- Gdy nerka znajdzie się poza jamą brzuszną, delikatnie oddziel ją od otaczającego tłuszczu na tyle, aby uwidocznić miedniczkę nerkową, małą białą kropkę (ryc. 1B). Zepchnij nadmiar tłuszczu na bok lub usuń w razie potrzeby. Należy pamiętać, aby nie usuwać nadnerczy, znajdującego się w pobliżu górnego bieguna nerki lub torebki nerkowej.
- Używając zamkniętych kleszczy, aby docisnąć prawą stronę nerki, tak aby miedniczka nerkowa pozostała w zasięgu wzroku, chwyć załadowaną strzykawkę z insuliną prawą ręką i trzymaj ją równolegle do powierzchni roboczej z igłą skierowaną na miedniczkę nerkową (ryc. 2E). Ostrożnie wprowadzić igłę do miedniczki nerkowej unieruchomionej nerki, jak pokazano na rysunku 1B.
- Wstrzyknąć roztwór szybko, w ciągu trzech sekund. Około jedna trzecia nerki może się oczyścić i zmienić kolor na biały.
UWAGA: Często obserwuje się gromadzenie się płynu w torebce nerkowej po wstrzyknięciu, a także tworzenie się krwiaka. Pewne uszkodzenia są konieczne, aby osiągnąć wystarczający poziom transfekcji DNA do wykrycia.
- Trzymaj igłę na miejscu przez około 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się roztworu. Następnie ostrożnie i powoli wyjmij igłę. Przywróć narząd do jamy brzusznej, delikatnie rozciągając miejsce nacięcia i używając zamkniętych kleszczy.
- Zszyj warstwę mięśniową zwierzęcia za pomocą 5-0 wchłanialnych szwów, umieszczając 2–4 niezależne węzły.
- Zszyj warstwę skóry zwierzęcia niewchłanialnymi szwami nylonowymi 5-0 lub 6-0, umieszczając 2-4 niezależne węzły.
UWAGA: Narzędzia chirurgiczne mogą być ponownie użyte po umieszczeniu w sterylnej kąpieli perełkowej i schłodzeniu.
