$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Implantacja komórek
Aby wszczepić komórki Renca donerkowo, przygotuj komórki Renca do jednokomórkowego zawiesiny o stężeniu 2 x 106 komórek/ml w Zrównoważonym Roztworze Soli Hanka (HBSS).
- Usunąć przylegające komórki Renca z kolby do hodowli tkankowej, używając 0,25% trypsyny w HBSS. Po ~5 minutach dodaj cały RPMI do kolby, aby zneutralizować trypsynę i przenieś komórki do probówki wirówkowej w celu przemycia. Odwirować komórki przy względnej sile odśrodkowej g 300 (rcf x g) przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
- Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w HBSS. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj objętość za pomocą HBSS, aby uzyskać 2 x 106 komórek/ml.
- Pobrać komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby zapobiec naprężeniom ścinającym na komórkach. Zastąp igłę o rozmiarze 18 igłą o rozmiarze 28 przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych. Wstrzyknięcie 0,1 ml dostarcza 2 x 105 komórek do nerki.
2. Przygotowanie obszaru operacyjnego
- Przygotuj sterylne pole operacyjne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, umieszczając sterylną serwetę chirurgiczną na poduszce grzewczej. Zbierz wszystkie zapasy, w tym kleszcze, skalpel, nożyczki, krople do oczu, 5% środek antyseptyczny powidonowo-jodowy i sterylną gazę. Autoklaw wszystkie instrumenty przed użyciem.
- Wykonaj operację przy użyciu techniki aseptycznej końcówki. Ponownie sterylizuj narzędzia między zwierzętami za pomocą sterylizatora koralików. Nosić sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny i maskę na twarz.
3. Przygotowanie zwierząt
- Znieczulenie myszy ketaminą/ksylazyną (odpowiednio 87,5 mg/kg i 12,5 mg/kg, i.p.) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Określ głębokość znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi.
- Gdy zwierzę zostanie uznane za niereagujące, należy przygotować miejsce wstrzyknięcia (np. lewy bok) u myszy Balb/c, wyrywając (palcami) lub goląc (za pomocą maszynki do strzyżenia) sierść.
- Przenieś myszy z obszaru przygotowania do operacji (np. klatki mieszkaniowej) do obszaru operacyjnego i nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Obficie przetrzyj przygotowane miejsce nacięcia 5% środkiem antyseptycznym powidonowo-jodowym.
- Wstrzyknąć chlorowodorek bupiwakainy (0,1 ml roztworu o stężeniu 2,5 mg/ml s.c.) w miejsce, w którym zostanie wykonane nacięcie, jako przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.
- Wykonaj pojedyncze nacięcie (~1,0 do 1,5 cm) na lewym boku zwierzęcia za pomocą sterylnego skalpela lub nożyczek, ostrożnie, aby nie przebić otrzewnej. Oddziel skórę właściwą od otrzewnej sterylnymi nożyczkami. Przetrzyj miejsce nacięcia sterylną gazą bawełnianą, aby usunąć krew.
- Trzymaj mysz obiema rękami, lewą ręką trzymaj głowę, a prawą ręką podpieraj bok.
- Zidentyfikuj śledzionę przez otrzewną i jednym palcem prawej ręki obmacuj mysz od spodu; nerka powinna być teraz widoczna przez otrzewną. Trzymaj zwierzę mocno, aby zapewnić napięcie w poprzek otrzewnej i nerek.
- Poproś drugą osobę o wstrzyknięcie komórek nowotworowych (przygotowanych w sekcji 1.2) przez nienaruszoną otrzewną do środka nerki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 28. Powoli dostarczaj 0,1 ml (2 x 105) komórek. Po wstrzyknięciu komórek należy przytrzymać igłę na miejscu przez 5–10 sekund, aby zmniejszyć cofanie się komórek. Ważne jest, aby pamiętać o konieczności zachowania szczególnej ostrożności podczas tego etapu, ponieważ osoba wstrzykująca komórki zbliży igłę do palców osoby trzymającej mysz.
- Wyjąć igłę i zamknąć nacięcie cienką warstwą kleju tkankowego z cyjanoakrylanu.
- Umieść zwierzę z powrotem w czystej klatce ze sterylnym ręcznikiem papierowym. Pozwól zwierzętom dojść do siebie na poduszce grzewczej. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki w okresie rekonwalescencji. Nie należy przywracać zwierząt do standardowych warunków w pomieszczeniach, dopóki nie osiągną pozycji pionowej i mostkowej. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi we wszystkich procedurach z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych.