Analiza ekspresji białek oparta na macierzach białek w odwróconej fazie: procedura jednoczesnej kwantyfikacji ekspresji wielu białek z lizatu komórkowego

Streszczenie

Źródło: O'Mahony, F. C. et al. Wykorzystanie macierzy białek odwróconej fazy (RPPA) do badania zmienności ekspresji białek w obrębie poszczególnych nowotworów nerek. J. Vis. Exp. (2013)

Ten film demonstruje metodologię wykonywania Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) w celu zbadania wzorców ekspresji białek z lizatu komórkowego. W RPPA, lizat zawierający mieszaninę białek jest drukowany na szkiełkach nitrocelulozowych, a interesujące białka są analizowane za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Protokół

1. Drukowanie RPPA

1. Lizaty białkowe namierzono na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą (Fastslides-Whatman) za pomocą robota spottera MicroGrid II. Użyte preparaty zawierały 2 podkładki, na których nanoszono próbki. Na każdym klocku wykryto identyczne próbki, w tym przypadku 100 próbek. Inne dostępne formaty to prowadnice z 1, 8 i 16 padami. Im większa liczba padów, tym mniejsza liczba próbek, które można dostrzec na każdej
z nich.
2. Z każdej próbki wykonano serię pięciu 2-krotnych rozcieńczeń, a następnie każdą z nich nakrapiano w trzech egzemplarzach (co dało w sumie 15 plamek na próbkę).

2. Wykrywanie białek RPPA

1. Mokre szkiełka w nadmiarze buforu blokującego LiCor (rozcieńczonego 50:50 w PBS). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na platformie bujanej.
2. Przygotować 800 μl pierwszorzędowych przeciwciał w buforze blokującym LiCor (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) w żądanych stężeniach i przechowywać na lodzie.
3. Zamontuj szkiełka w (i) pojedynczym ramie Chip Clip lub (ii) czterokieszeniowym uchwycie prowadnicy "FastFrame" tak, aby między szkiełkiem a komorą inkubacyjną powstało szczelne uszczelnienie.
4. Usunąć pozostały bufor z dołków i dodać 600 μl przeciwciała pierwszorzędowego do odpowiednich studzienek.
5. Umieścić szkiełko i komorę w szczelnie zamkniętym mokrym pojemniku i inkubować na platformie bujanej przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Uzupełnić 0,1% PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL PBS).
7. Wyjmij szkiełka z chłodni i ostrożnie usuń pierwszorzędowe przeciwciała z każdej studzienki.
8. Dodaj 600 μL PBS-T i myj szkiełka na platformie bujanej w temperaturze RT przez 5 min (X3).
9. Przygotować znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe, rozcieńczając w pierwszej kolejności w buforze blokującym Odyssey (rozcieńczonym w stosunku 50:50 w PBS) 0,01% SDS w rozcieńczeniu 1:2,000 (1 μl/2 ml).
10. Usunąć bufor z dołków i dodać 600 μl znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych do odpowiednich studzienek. Inkubować przeciwciała drugorzędowe w temperaturze pokojowej przez 45 minut, delikatnie wstrząsając; Ważne jest, aby chronić membranę przed światłem do czasu, gdy zostanie ona ostatecznie zeskanowana.
11. Usunąć przeciwciała drugorzędowe ze studzienki i krótko przemyć (x3) w 600 μl PBS-T w temperaturze pokojowej. Wyjąć szkiełko z nośnika, przenieść do odpowiedniego pojemnika i myć nadmiar PBS-T przez 15 minut, trzymając membranę w ciemności.
12. Usuń PBS-T i dalej myj membranę PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby usunąć resztki Tween-20, ponownie utrzymując membranę w ciemności.
13. Suszyć Fastslide w piekarniku w temperaturze 50 °C przez 10 minut, a następnie zeskanować na skanerze Li-Cor Odyssey. Trzymaj slajd w ciemności, dopóki nie zostanie zeskanowany.
14. Zeskanuj szkiełko przy długości fali 680 nm i/lub 800 nm, w zależności od użytego przeciwciała lub przeciwciał drugorzędowych. Do wykrywania dwukolorowego zawsze używaj wysoce zaadsorbowanych przeciwciał drugorzędowych, aby zminimalizować reaktywność krzyżową. Staranny dobór przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych jest konieczny do wykrywania dwukolorowego. Zasadnicze znaczenie ma selekcja różnych gatunków żywicieli (np. królika i myszy) dla dwóch podstawowych przeciwciał. Pozwala to na dyskryminację za pomocą drugorzędowych przeciwciał anty-króliczych i anty-myszy, które są znakowane barwnikiem o łatwo rozróżnialnych widmach emisyjnych.
15. Pliki obrazów są zapisywane jako pliki .tiff. Rysunek 1 przedstawia obraz zeskanowanych plików.

Wyniki

Rysunek 1. Diagram przepływu procesu skanowania RPPA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tryton X-100	Tryton-X	Zobacz materiał T8787
Bufor blokujący Li-Cor Odyssey	Akumulator litowo-polimerowy	927-40000
Zrobotyzowany obserwator MicroGrid II	Biorobotyka
Czterokieszeniowy uchwyt przesuwny FastFrame	Whatman	10486001
Prowadnica FAST - 2-padowa	Whatman	10485317
IRDye 680LT Koza anty-mysia IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW Koza anty-królicza IgG	Licor	926-32211

TGL