Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotować 50-krotny roztwór podstawowy pożywki dla zarodków E3, mieszając 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 i 9,95 gMgSO4 w 5 l wody destylowanej i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 50-krotny roztwór podstawowy pożywki dla zarodków E3, mieszając 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl2 i 9,95 gMgSO4 w 5 l wody destylowanej i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- W przypadku hodowli zarodków danio pręgowanego rozcieńczyć 50x roztwór podstawowy podłoża zarodkowego E3 do 1x roztworu roboczego wodą destylowaną, a następnie dodać 200 μl 0,05% błękitu metylenowego do każdego 1 litra 1x E3, aby działał jako fungicyd i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować roztwór blokujący pigmentację pożywki zarodkowej E3 z 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU), łącząc 40 ml 50x E3 z 0,06 mg PTU. Następnie doprowadzić objętość do całkowitej objętości 2 l wodą destylowaną.
- Wymieszaj E3/PTU O/N w temperaturze pokojowej, aby proszek PTU znalazł się w roztworze. Następnie przechowuj E3/PTU w RT.
nuta: Okres trwałości E3/PTU wynosi około jednego tygodnia, a starsze roztwory będą mniej skuteczne w blokowaniu rozwoju pigmentacji u larw danio pręgowanego.
- Przygotować roztwór znieczulający składający się z 0,2% trikainy (MS-222), dodając 1 g trikainy do 500 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 M Tris, pH 9,5.
2. Przygotowanie narzędzi
- Przygotuj narzędzie do manipulowania zarodkami, używane do pozycjonowania zarodków do mikrowstrzyknięcia, mocując końcówkę ładującą żel na końcu 5-calowej prostej igły preparacyjnej i zabezpiecz taśmą lub klejem superglue.
- Przygotuj igły do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do igieł, umieszczając najpierw polerowane ogniowo szkło borokrzemianowe o średnicy 10 cm z żarnikiem w instrumencie i zabezpiecz szkło borokrzemianowe, dokręcając uchwyty.
- Pociągnij szkło borokrzemianowe, aby uzyskać drobno stożkowe igły. Użyj następujących ustawień: ciepło 540, ciąg 245, prędkość 200 i czas 125.
- Umieść igły wewnątrz szalki Petriego, zawieszając je na pasku plasteliny, aby chronić końcówki igieł, i trzymaj naczynie przykryte, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.
- Aby zakończyć przygotowanie igły do mikrowstrzyknięć, użyj żyletki lub cienkiej krawędzi kleszczy, aby przeciąć naciągnięty koniec igły, aby utworzyć ostrą, kątową końcówkę iniekcji o średnicy około 0,05–0,1 mm.
- Aby przygotować tackę do mikroiniekcji, przygotuj 1,5% roztwór agarozy/E3 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml i rozpuść agarozę, podgrzewając E3 do wrzenia w kuchence mikrofalowej, a następnie pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 10 minut.
- Wlej schłodzony roztwór agarozy/E3 na szalkę Petriego, aby utworzyć fundament o głębokości około 0,5 cm. Gdy to zastygnie, wlej drugą warstwę o głębokości około 0,3 cm i włóż prefabrykowaną formę do studzienki zarodkowej i pozwól agarozie zestalić się w temperaturze RT.
nuta: Podczas wkładania formy do górnej warstwy agaru/E3, umieść formę w agarze pod kątem, aby zmniejszyć liczbę pęcherzyków powietrza.
- Gdy cała tacka do mikroiniekcji jest już ustawiona, należy dobrze podnieść prefabrykowany zarodek, powoli i ostrożnie uformować za pomocą czerpaka, a następnie napełnić naczynie roztworem E3 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Mikroiniekcja roztworu nefrotoksyny
- W dniu wstrzyknięcia należy przygotować żądany roztwór nefrotoksyny wraz z odpowiednią kontrolą nośnika.
- Delikatnie wymieszać lub wymieszać, aby upewnić się, że lek(i) jest/są w roztworze, sprawdzając boki rurki i górną część słupa wody.
nuta: Roztwory nefrotoksyn można przygotować tak, aby zawierały śladowe ilości fluorescencyjnie sprzężonego dekstranu w celu monitorowania skuteczności mikroiniekcji, a także oceny klirensu nerkowego w kolejnych punktach czasowych.
- Załadować przyciętą igłę do mikroiniekcji ~ 2–3 μl nefrotoksyny, nawlekając cienką końcówkę ładującą żel z tyłu igły i zawiesić igłę pionowo za pomocą kawałka taśmy, aby roztwór mógł grawitacyjnie wypełnić przyciętą końcówkę igły.
- Gdy końcówka igły jest pełna, zabezpiecz załadowaną igłę w mikromanipulatorze.
- Zbadaj objętość mikroiniekcji, umieszczając kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i wstrzyknij do oleju, aby ocenić wielkość kropli. Objętość wtrysku 500 pl ma średnicę 0,1 mm.
- Wyjąć szalkę z zarodkami z inkubatora i znieczulić, dodając około 5 ml 0,2% trikainy do szalki z zarodkami.
- Aby zapewnić całkowite znieczulenie, delikatnie dotknij zarodka końcówką narzędzia do manipulowania zarodkami. Brak ruchu wskazuje na wystarczające znieczulenie.
- Po udanym znieczuleniu przenieś zarodki do formy iniekcyjnej za pomocą pipety transferowej.
- Manewruj każdym zarodkiem w innym dołku pleśni, umieszczając głowę w najgłębszym obszarze studzienki tak, aby tułów spoczywał wzdłuż zagłębienia, a ogon wystawał z zagłębienia.
- Wprowadzić wypełnioną igłę do mikromanipulatora i umieścić końcówkę igły obok zarodka.
- Delikatnie włóż igłę do naczynia ogonowego, przesuwając joystick do przodu i wciśnij pedał nożny, aby wprowadzić mikrowstrzyknięcie.
nuta: Udane wstrzyknięcie można ocenić, obserwując, jak ciecz wchodzi do obiegu. Co więcej, jednoczesne wstrzyknięcie nefrotoksyny z fluorescencyjnie sprzężonym dekstranem umożliwia badaczowi zweryfikowanie udanego wstrzyknięcia po zabiegu.
- Delikatnie pociągnij joystick do tyłu, aby wyjąć igłę z zarodka.
- Po wstrzyknięciu przenieść zarodki do czystego naczynia i spłukać w celu usunięcia trikainy i zastąpić ją świeżym E3/PTU.
- Inkubuj zarodek do pożądanego punktu czasowego, aby ocenić morfologię, którą można udokumentować za pomocą fotografii w pożywce montażowej metylocelulozy lub procesu analizy eksperymentalnej zgodnie z życzeniem.
nuta: Odzyskiwanie zarodków powinno być oceniane w celu określenia odsetka osób z obrzękiem, który zwykle wskazuje na uszkodzenie nerek.
