Depigmentacja i wstępne barwienie nerki danio pręgowanego: technika przygotowania nerki dorosłego danio pręgowanego do barwienia

Streszczenie

Źródło: McCampbell, K. K. et al. Analiza składu i funkcji nefronu w nerce dorosłego danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2014)

W tym filmie pokazujemy depigmentację nerki dorosłego danio pręgowanego i jej późniejsze przygotowanie do zabiegów barwienia. Po barwieniu dorosła nerka danio pręgowanego może być wykorzystana do badania regeneracji nerek, charakterystyki fenotypowej modeli chorób nerek i funkcjonalności nefronów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Utrwalenie, rozwarstwienie, przepuszczalność i usuwanie pigmentacji nerki dorosłego danio pręgowanego

1. Przygotować świeży roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu (PFA)/1X PBS/0,1% DMSO lub rozmrozić zamrożoną porcję 4% PFA/1X PBS i dodać 0,1% DMSO.
   UWAGA: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA należy obchodzić się z kapturem chemicznym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. Ponadto z proszkiem PFA należy obchodzić się ostrożnie podczas przygotowywania roztworu podstawowego.
2. Napełnij tacę sekcyjną roztworem utrwalającym w ilości wystarczającej do zanurzenia całego zwierzęcia.
3. Poddaj eutanazji i umieść wybranego danio pręgowanego w roztworze utrwalającym.
   nuta: Wybrana ryba może być nieleczoną próbką nerki danio pręgowanego lub nerką wyizolowaną od danio pręgowanego, która wcześniej otrzymała dootrzewnowe wstrzyknięcie dekstranu.
4. Ustalić próbkę O/N (12–16 godzin) w temperaturze 4 ^oC.
5. Następnego dnia za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie odłącz nerkę od grzbietowej ściany ciała i umieść narząd w szklanej fiolce za pomocą pipety transferowej.
   UWAGA: Alternatywnie można użyć 12-dołkowego lub 24-dołkowego naczynia do hodowli. Podczas gdy można użyć plastikowej probówki do mikrowirówki, probówki o standardowych rozmiarach (1,5 ml) mogą ograniczać mycie.
6. Umyj wypreparowaną nerkę 3 razy za pomocą 3-5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
7. Usunąć 1X PBS za pomocą 0,05% Tween i płukać nerkę 3 ml 5% roztworu sacharozy (w 1X PBS) przez 30 minut.
8. Zastąp 3 ml 30% roztworu sacharozy (w 1X PBS) i przechowuj O/N (12-16 godzin) w temperaturze 4 ^oC.
   UWAGA: Roztwory sacharozy przenikają przez błony komórkowe, umożliwiając następnie specyficzne znakowanie odczynników podczas ich wnikania do tkanki.
9. Następnego dnia usuń 30% roztwór sacharozy i przemyj nerkę 2 razy 5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
10. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3-5 ml roztworu wybielającego, aby usunąć pigmentację melanocytów obecną na narządzie nerkowym.
11. Umieść szklaną fiolkę na rotatorze i uważnie obserwuj, jak pigmentacja znika.
    UWAGA: Depigmentacja trwa zazwyczaj około 20 minut, gdy jest wykonywana po leczeniu sacharozą, ale czasami może trwać nawet 60 minut. Jeśli roztwór wybielający pozostanie na nerce zbyt długo, może dojść do rozpadu narządu; Zaleca się monitorowanie próbki co 10–15 minut w celu sprawdzenia integralności tkanki.
12. Po usunięciu pigmentacji z nerki przemyj dwukrotnie 3-5 ml 1X PBS z 0,05% Tween.
13. Zastąp 1X PBS 0,05% Tween 3–5 ml 4% roztworu PFA na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
14. Usuń 4% roztwór PFA i umyj nerkę 3 razy 3–5 ml 1X PBS z 0,05% Tween przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Po zakończeniu utrwalenia nerkę można również zamontować na szklanym szkiełku podstawowym i ocenić pod kątem wychwytu dekstranu bez pigmentacji melanocytów.
15. Usuń 1X PBS z 0,05% Tween i zastąp 3-5 ml roztworu blokującego, a następnie inkubuj nerkę w temperaturze RT w bloku przez 2 godziny.
16. Po zakończeniu blokowania przejdź bezpośrednio do wybranego protokołu barwienia.
    UWAGA: Nerka może być teraz przetworzona przez jedną lub więcej innych procedur w celu przeprowadzenia badań znakowania z różnymi odczynnikami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1X PBS			Wykonane przez rozcieńczenie 10X PBS w wodzie destylowanej
1X PBST			0,1% detergent Tween-20 w 1X PBS
1X PBS z animacją 0,05 %			0,05% detergent Tween-20 w 1X PBS
Animacja 20	Amerykański bioanalityk	AB02038
4% PFA/1X PBS			Rozpuść 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat #19210) w 1X PBS, doprowadź do wrzenia na gorącej płycie w dygestorium. Schłodź i zamroź porcje do przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20°C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie bulionu
Roztwór wybielający			Formuła mieszanki wybielacza (na 20 ml roztworu): 1,6 ml 10% roztworu wodorotlenku potasu 0,6 ml 30% roztworu nadtlenku wodoru 100 μl 20% Tween Napełnij do 20 ml wodą destylowaną
Wodorotlenek potasu	Sigma	221473
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009
Rozwiązanie blokujące			Roztwór blokujący (na 10 ml roztworu): 8 ml 1X PBS z 0,05% Tween 2 ml płodowej surowicy cielęcej 150 μl DMSO