Patologia ekspansji: metoda obrazowania optycznego w wysokiej rozdzielczości klinicznych próbek tkanek

Abstract

Źródło: Klimas, A. et al. Nanoskopowe obrazowanie skrawków tkanek ludzkich poprzez fizyczną i izotropową ekspansję.J. Vis. Exp.(2019 rok)

W tym filmie opisujemy metodę zwaną patologią ekspansji, wariant mikroskopii ekspandywnej, w którym kliniczne próbki tkanek są chemicznie ekspandowane za pomocą sieci polimerowej do mikroskopowego badania struktur w nanoskali.

Protocol

1. Polimeryzacja próbek in situ

1. Inkubować próbkę w roztworze kotwiącym.
   1. Przygotować roztwór zakotwiczający (zwykle 250 μl wystarcza do pokrycia przekroju tkanki), rozcieńczając roztwór podstawowy AcX w 1x PBS do stężenia 0,03 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami niealdehydowymi lub 0,1 mg / ml dla próbek utrwalonych utrwalaczami aldehydowymi, które mają mniej wolnych amin dostępnych do reakcji z AcX.
   2. Umieścić szkiełko podstawowe na szalce Petriego o średnicy 100 mm i odpipetować roztwór zakotwiczający na tkance. Inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Próbki należy inkubować w roztworze żelującym.
   1. Przygotować co najmniej 100-krotny nadmiar roztworu żelującego. Na 200 μl należy połączyć kolejno: 188 μl roztworu monomeru, 4 μl 0,5% roztworu podstawowego 4HT (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe: 0,01%), 4 μl 10% roztworu podstawowego TEMED (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%) i 4 μl 10% roztworu podstawowego APS (rozcieńczenie 1:50, stężenie końcowe 0,2%).
      UWAGA: Roztwór żelujący należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a roztwór APS należy dodawać na końcu, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu.
   2. Usunąć nadmiar roztworu z wycinka tkanki i umieścić szkiełko na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Dodać świeży, zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję roztworu do tkanki.
3. Skonstruuj komorę na szkiełku wokół próbki (rysunek 1A) bez naruszania roztworu żelującego.
   1. Wykonać przekładki do komory żelowania, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego za pomocą noża diamentowego.
      UWAGA: Aby ułatwić obrazowanie po rozprężeniu, przekładki powinny być zbliżone pod względem grubości do próbki tkanki, aby zmniejszyć ilość ślepego żelu nad tkanką. Szkło o numerze 1,5 może być używane do standardowych próbek klinicznych (5−10 μm). Kawałki szkła nakrywkowego można układać w stosy w celu uzyskania grubszych próbek.
   2. Zabezpiecz przekładki po obu stronach chusteczki za pomocą kropelek wody (~10 μL).
   3. Ostrożnie umieść szklaną pokrywkę na szkiełku, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza na chusteczce (Rysunek 1B).
4. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku (takim jak zamknięta szalka Petriego z wilgotną chusteczką) przez 2 godziny
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Komora szkiełkowa może być przechowywana w szczelnie zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 4 °C.

2. Trawienie próbki

1. Zdejmij pokrywę komory żelowania, delikatnie wsuwając żyletkę pod szkiełko nakrywkowe i powoli podnosząc szkiełko nakrywkowe z powierzchni żelu. Przytnij czysty żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość. Wytnij żel asymetrycznie, aby śledzić orientację żelu po homogenizacji, ponieważ próbka stanie się przezroczysta.
   1. Przed użyciem rozcieńczyć ProK w stosunku 1:200 w buforze wytrawiającym (końcowe stężenie 4 U/ml). Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie zanurzyć żel; pojedynczy dołek z czterodołkowej płytki do hodowli komórkowej z tworzywa sztucznego wymaga co najmniej 3 ml na studzienkę.
   2. Inkubować próbkę w zamkniętym pojemniku zawierającym bufor do wytrawiania przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Jeśli próbka nie odczepia się od szkiełka podczas trawienia, użyj żyletki, aby delikatnie usunąć próbkę.
      UWAGA: Próbkę należy całkowicie zanurzyć w buforze do wytrawiania, aby zapobiec wysychaniu próbki i umieścić w zakrytym pojemniku (małe pudełko na suwaki, plastikowa studzienka, szalka Petriego itp.), który można uszczelnić folią.

3. Rozszerzanie próbki i obrazowanie

1. Użyj miękkiego pędzla, aby przenieść próbkę do 1x PBS w pojemniku kompatybilnym z żądanym systemem obrazowania i wystarczająco dużym, aby pomieścić w pełni rozprężony żel. Upewnij się, że tkanka jest umieszczona próbką do dołu w przypadku obrazowania w systemie odwróconym lub do góry w przypadku obrazowania w systemie pionowym, aby zminimalizować odległość od obiektywu obrazowania do próbki. W razie potrzeby odwróć żel za pomocą miękkiego pędzla.
   nuta: Można zastosować boczne oświetlenie z diody LED, aby były one widoczne w cieczy. Standardowa płytka 6-dołkowa może pomieścić próbki, które mają wstępnie rozszerzoną średnicę mniejszą niż 0,6 cm. Do obrazowania w systemie odwróconym należy użyć płytki studzienkowej ze szklanym dnem.
2. Umyć próbki w 1 PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. W razie potrzeby ponownie zabarwić próbkę 300 nM DAPI, ponieważ proces trawienia zmywa plamę DAPI. Usunąć PBS i zaplamić 300 nM DAPI rozcieńczonym w 1x PBS przez 20 minut w temperaturze RT, a następnie 10 minuty prać 1x PBS w temperaturze RT.
   UWAGA: Próbki można pokryć 1x PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przed przejściem do następnego kroku.
3. Aby rozszerzyć próbki, należy wymienić PBS i przemyć nadmiarem objętości ddH₂O (co najmniej 10x końcowa objętość żelu) 3−5 razy przez 10 minut każde, w temperaturze RT.
   nuta: Po 3^{lub 4 myciu} ekspansja próbki powinna zacząć się stabilizować. W celu przechowywania, aby zapobiec rozwojowi bakterii, ddH₂O można uzupełnić 0,002%-0,01% azydkiem sodu (NaN₃). W takim przypadku końcowy współczynnik rozszerzalności jest odwracalnie zmniejszany o 10%.
4. Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonywać za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania.
   nuta: Aby zapobiec dryfowaniu żeli, nadmiar płynu można usunąć ze studni. Żele można również unieruchamiać 1,5−2% niskotopliwą agarozą. Przygotuj 1,5-2% (w/v) niskotopliwą agarozę w wodzie w pojemniku 2-4 razy większą od objętości roztworu. Podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C lub w kuchence mikrofalowej przez 10-20 s, aby rozpuścić roztwór. Odpipetować rozpuszczoną agarozę wokół brzegów żelu. Po pozostawieniu agarozy do stwardnienia w temperaturze pokojowej lub 4 °C, dodać wodę do próbki, aby zapobiec odwodnieniu.

Results

Rysunek 1: Komora żelowa dla próbek patologicznych. (A) Po inkubacji próbki w temperaturze 4 °C umieszcza się dwie przekładki, takie jak dwa kawałki szkła nakrywkowego #1,5 wycięte nożem diamentowym. Przekładki powinny być grubsze niż plastry tkanki, aby zapobiec ściskaniu próbki. (B) Pokrywka, taka jak kawałek szkła nakrywkowego #1,5, służy do przy...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-dołkowa szklana płyta dolna (#1,5 szkła nakrywkowego)	Komórka	P06-1.5H-N
aceton	Fischer Scientifc	A18-500
Akrylamid	Sigma Aldrich	Numer katalogowy A8887
Akryl-X SE, (AcX)	Invitrogen	Certyfikat A20770
Agarozy	Fischer Scientifc	Zobacz materiał BP160-100
Nadsiarczan amonu (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Inicjator
DAPI (1 mg/ml)	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 62248	Plama jądrowa
Nóż diamentowy nr 88 CM	Narzędzia ogólne	Numer katalogowy: 31116
etanol	Pharmco	111000200
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 0,5 M	Firma VWR	BDH7830-1
Próbka nerki FFPE	Złącze USBiomax	HuFPT072
Kleszcze
Mikro szklana osłona #1 (24 mm x 60 mm)	Firma VWR	Numer telefonu 48393 106
Szklana mikro osłona #1.5 (24 mm x 60 mm)	Firma VWR	Numer telefonu 48393 251
N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T9281	akcelerator
N,N′-metylenobisakryloamid	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M7279
Nunclon 6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych	Rybak termiczny	140675
Nunc 15 ml stożkowy	Rybak termiczny	339651
Nunc 50 ml stożkowy	Rybak termiczny	339653
Wytrząsarka orbitalna
Pędzlem
pH-metr
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10x roztwór	Fischer Scientifc	Zobacz materiał BP399-1
Plastikowa szalka Petriego (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinaza K (klasa biologii molekularnej)	Thermo Scientific	EO0491
żyletka	Fischer Scientifc	Numer katalogowy: 12640
Probówki do mikrowirówek Safelock 1,5 ml	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 3457
Probówki do mikrowirówek Safelock 2,0 ml	Rybak termiczny	3459
Akrylan sodu	Sigma Aldrich	Numer katalogowy: 408220
chlorek sodu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał S6191
Sodu cytrynian trójzasadowy dwuwodny	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C8532-1KG
Baza Tris	Fischer Scientifc	Zobacz materiał BP152-1
Tryton X-100	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T8787
ksylen	Sigma Aldrich	214736