$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Boczny dostęp pipetą do nerki poniżej kolumny obrazowania płynów za pomocą nowatorskiego zabiegu chirurgicznego
UWAGA: Montaż systemu wspomagającego obrazowanie i przygotowanie chirurgiczne pokazano na rysunku 1. Opisana procedura wykonywana jest na myszach C57BL/6 o masie ciała 20–25 g.
- Zważ mysz.
- Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu i utrzymuj za pomocą 1,5–2,5% izofluranu w mieszaninie powietrza i tlenu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona przez brak odpowiedzi na bolesny bodziec i zmniejszoną częstość oddechów.
- Nasmaruj oczy i ustaw zwierzę bokiem na płytce podstawowej. Unieruchomij 4 kończyny za pomocą taśmy.
- Wstrzyknąć podskórnie sól fizjologiczną zwykłą o pojemności 200 μl i umieścić sondę temperatury doodbytniczą. Kontroluj temperaturę za pomocą lampy grzewczej podczas operacji i poduszki grzewczej podczas obrazowania.
- Usuń wszystkie włosy po lewej stronie myszy za pomocą kremu do depilacji.
- Zlokalizuj śledzionę, która jest widoczna pod skórą, i zlokalizuj lewą nerkę po grzbietowej i ogonowej stronie śledziony.
- Wykonaj 0,5 cm nacięcie na skórze i mniejsze nacięcie na otrzewnej, tylko tyle, aby nerka mogła się łatwo przepchnąć.
- Wyciśnij nerkę z delikatnym naciskiem. Umieść formę stabilizatora nerki wykonaną z polisiloksanu wokół nerki i przymocuj za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Wyrównać nerkę z przekładką w taki sposób, aby najbardziej boczna powierzchnia nerki wystawała poza stabilizator na około 1 mm.
- Przymocuj płytę głowicy do formy stabilizatora za pomocą kleju i zamontuj płytę głowicy do prętów montażowych na płycie podstawy.
- Napełnij studzienkę w podłożu polisiloksanowym otaczającym nerkę 1% roztworem agarozy i umieść 10 mm szkiełko nakrywkowe na wierzchu i przytrzymaj, aż agaroza stanie się twarda. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe do płyty głowicy za pomocą kleju i utwórz pierścień wokół szkiełka nakrywkowego za pomocą cementu dentystycznego.
- Wstrzyknąć FITC-dekstran (2 000 000 Da, 5% roztwór, 100–150 μl) po orbicie i szybko przesunąć mysz i płytkę utrwalającą do stopnia mikroskopu 2-fotonowego, utrzymując znieczulenie i zapewniając odpowiednie oczyszczanie gazów odlotowych na stoliku mikroskopu.
2. Wybór odpowiedniego kłębuszka nerkowego i pipety Dostęp do przestrzeni Bowmana
- Definicje:
- Zdefiniuj X jako lewo-prawo na ekranie i lewo-prawo skierowane w stronę mikroskopu
- Odczyt SX (stage X) z stage kontrolera
- Zdefiniuj PX jako pipetę X na sterowniku tarczy pipety
- Zdefiniuj Y jako góra-dół na ekranie i do przodu w kierunku mikroskopu i z powrotem w kierunku konfiguracji 2-fotonowej
- Zdefiniuj Z jako w górę w kierunku sufitu, w dół w kierunku podłogi i mierzoną na stole montażowym z położeniem celu Z.
- Zdefiniuj S(O)Z jako wysokość sceny (a właściwie obiektywną).
- Znajdź powierzchnię nerki, którą można zidentyfikować za pomocą ustawień filtra białka zielonej fluorescencji (GFP) w okularze. Ze względu na wstrzyknięcie FITC-Dextran, naczynia krwionośne będą jasnozielone.
- Zidentyfikuj odpowiedni kłębuszek nerkowy. Po zidentyfikowaniu powierzchni nerki za pomocą okularu przełącz się na 2-fotonowy (tryb bez skanowania) i zbadaj okno obrazowania. Korzystne cechy mikronakłucia to: odległość pionowa poniżej szkiełka nakrywkowego >30 μm (aby zapobiec kolizji pipety z szkiełkiem nakrywkowym podczas dostępu) oraz odległość boczna od bocznej torebki nerkowej do kłębuszków nerkowych <400 μm (powyżej tej odległości odchylenie pipety może zwiększyć prawdopodobieństwo chybienia).
- Zapisać odległość boczną i pionową do punktu nakłucia, punkt na torebce nerkowej bezpośrednio po stronie pipety kłębuszków nerkowych.
- Podnieś ognisko obiektywu do słupa wody, zachowując niezmienione współrzędne stopnia x i y, zaledwie o około centymetr.
- Wbij końcówkę pipety do słupa wody i włącz wzbudzenie 4',6-diamidyno-2-fenylindoldol (DAPI). Przesuń pipetę w wymiarach x i y do punktu maksymalnej fluorescencji końcówki, będzie to środek obiektywu. Znalezienie pipety w oku jest trudne bez tego precyzyjnego pozycjonowania. Ponieważ kropki kwantowe fluoryzują na tej samej (w tym przypadku na czerwono) długości fali, niezależnie od długości fali wzbudzenia, wzbudzenie DAPI wytwarza czerwoną fluorescencję, która jest ściśle skupiona na końcówce, jak pokazano na rysunku 2.
- Zmień ustawienie wzbudzenia na czerwone białko fluorescencyjne (RFP) i wizualizuj pipetę w okularze, a następnie precyzyjnie wyśrodkuj ją w widoku oka.
- Przełącz się na 2-foton i znajdź pipetę w kategorii 2-photon, umieszczając ją dokładnie na środku obrazu. To jest stanowisko rejestracyjne.
- Zapisz zdjęcie pipety.
- Zarejestruj stolik i współrzędne kontrolera mikropipet.
nuta: Użyj dodatkowego pliku .html, który wykona obliczenia za pomocą kodu JavaScript (korzystne w systemach, które nie mają zainstalowanego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych) lub arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć przesunięcie między współrzędnymi stolika i pipety oraz obliczyć współrzędne docelowe sterownika pipet.
- Wyjmij pipetę ze słupa wody w osi x, pozostawiając te same wartości z i y.
- Przesunąć pipetę Z do docelowego kłębuszka Z (tj. przesunąć pipetę w dół w kierunku Z poniżej szkiełka nakrywkowego)
- Przesunąć pipetę Y do docelowej współrzędnej Y kłębuszków nerkowych.
- Przesuń 2-fotonowy podgląd na żywo do docelowego kłębuszka nerkowego Z, a następnie do krawędzi nerki i zanotuj SX.
- Oblicz PX krawędzi nerki, korzystając z przesunięcia od rejestracji SX.
- Przesuń stolik w kierunku pipety (zwiększ SX) tak, aby krawędź nerki znajdowała się daleko na lewo od ekranu, ale nadal była widoczna.
- Szybko przesunąć pipetę do wartości o około 100 μm mniejszej niż PX na krawędzi nerki obliczonej powyżej.
- Zlokalizuj końcówkę pipety, powoli przesuwając pipetę. Zwiększ wzmocnienie czerwieni i obserwuj histogram czerwonych pikseli (rozkład pikseli zmienia się przed obrazowaniem pipety w oknie, ze względu na ekstremalną jasność kropek kwantowych i fluorescencję poza celem).
- Przejdź do krawędzi nerki w obrazowaniu 2-fotonowym na żywo.
nuta: Przed wprowadzeniem do torebki nerkowej możliwe jest przekierowanie pipety w wymiary Y i Z. Może to jednak spowodować uszkodzenie końcówki pipety. Bardziej konserwatywnym środkiem, jeśli pipeta nie jest zamierzona, jest wycofanie w wymiarze X do 2 cm, przekierowanie, a następnie powrót w wymiarze X do krawędzi nerki. Gdy pipeta znajdzie się w tkance, ruch w dowolnej osi innej niż X prowadzi do zgięcia pipety, co wymaga dużego doświadczenia i często prowadzi do pęknięcia.
- Powoli kieruj pipetę w osi X do docelowego PX, obserwując SX. (Pomocne jest od czasu do czasu wracanie do kłębuszka nerkowego, aby sprawdzić, czy w ogóle się przesunął po włożeniu mikropipety).
- Gdy znajdujesz się we właściwej lokalizacji, udokumentuj pozycję za pomocą z-stack.
nuta: Po założeniu mikropipety można wstrzykiwać leki, białka lub znaczniki fluorescencyjne, zasysać płyn do późniejszej analizy lub mierzyć ciśnienie lub ładunek w stosunku do innej elektrody.
3. Aspiracja płynu z Przestrzeni Bowmana
- Ustaw mikropompkę tak, aby wstrzykiwała 100 nl perfluorodekaliny w ciągu 2 minut, aby zapewnić drożność pipety i zmniejszyć zakłócenia spowodowane zatkaniem pipety podczas wprowadzenia. Zobrazuj ponownie, aby upewnić się, że pipeta znajduje się w pozycji.
- Odczekaj 4–6 minut na dodatkową filtrację.
- Ustawić mikropompę tak, aby zasysała do 300 nL z szybkością do 50 nL/min.
nuta: Zmiany w morfologii kłębuszków nerkowych nie są obserwowane przy tym tempie, co sugeruje, że nie zmienia to szybkości dostarczania płynu do przestrzeni podczas aspiracji. Ponieważ nie ma bloku olejowego, jak w konwencjonalnej mikronakłuwalce, odzyskanie tej objętości, niezbędne do spektrometrii mas, może obejmować część wstrzykniętej perflourodekaliny i ewentualnie płyn rurkowy. W przypadku testów, takich jak pomiary elektrod wrażliwych na jony, spektroskopia fluorescencyjna, reakcja łańcuchowa polimerazy i inne wrażliwe punkty końcowe, można stosować mniejsze objętości. Jeżeli spektrometria mas nie jest punktem końcowym, do pomiaru zasysanej objętości przed przechowywaniem można zastosować olej mineralny i standardowe techniki mikronakłuwania.
- Obraz jeszcze raz.
- Wyjąć pipetę i zakonserwować próbkę, dodając bufor TRIS i przechowując w temperaturze -80° przed analizą.
- Poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu lub innej zatwierdzonej metody.
nuta: Filtrat dostaje się do przestrzeni poprzez filtrację z naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych. Współczynnik filtracji kłębuszkowej pojedynczego nefronu (SNGFR) u myszy wynosi od 8 do 14 nL/min. Siły Starlinga rządzą jednak SNGFR, a zatem ujemne ciśnienie hydrostatyczne w przestrzeni Bowmana może zwiększyć SNGFR. Standardowe metody mikronakłuwania wykorzystują blokadę rurkową z olejem i neutralnym ciśnieniem do pobierania próbek płynu rurowego, jednak związki te zakłócają spektrometrię mas (patrz poniżej); Dlatego w tej technice wczesny kanalik proksymalny pozostaje opatentowany. Co więcej, w momencie aspiracji przestrzeń Bowmana zawiera nieznaną, ale dodatnią objętość filtratu. W związku z tym szybkość aspiracji płynu może przekroczyć SNGFR.
nuta: W opisanych tutaj eksperymentach celem było uzyskanie większej niż zwykle próbki filtratu kłębuszkowego do analizy spektrometrii mas za pomocą technik nanoproteomicznych. Ponieważ zastosowanie spektrometrii mas wyklucza stosowanie bloków olejowych z olejem mineralnym lub woskiem (złożone mieszaniny cząsteczek organicznych, które redukują sygnał: szum w spektrometrii mas), perfluorodekalina jest używana do napełniania mikropipety i strzykawki. Nie wiadomo, czy perflourodekalina blokuje przepływ rurowy, ale jest biologicznie obojętna i nie zakłóca spektrometrii mas.
