Organotypowa hodowla nerek na CAM kurczaka: technika przeszczepiania mysich eksplantatów nerek na CAM kurczaka w celu wywołania powstania architektury naczyń nerkowych

Streszczenie

Źródło: Kaisto, S. et al. Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, rozszerzonego rozwoju i ulepszonego obrazowania mikroskopowego. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje metodę badania rozwoju narządów za pomocą ulepszonego zestawu ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów. Metoda ta pozwala na rozwój w pełni unaczynionych, hodowanych narządów embrionalnych i organoidów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE

1. Produkcja minizbiorników do hodowli embrionalnych nerek myszy i organoidów nerkowych na CAM kurczaka i przeprowadzanie eksperymentów ksenotransplantacyjnych

1. Stosować wkładki do hodowli komórkowych transwell przeznaczone do płytek 6-dołkowych lub 12-dołkowych.
   nuta: W zależności od konkretnego eksperymentu można zastosować duże lub małe minizbiorniki. Najlepiej jest używać małych minizbiorników do ksenoprzeszczepu do ośmiu nerek embrionalnych lub gdy kilka minizbiorników zostanie umieszczonych na tym samym zarodku kurczaka (np. próbki eksperymentalne i kontrolne na tym samym CAM kurczaka).
2. Wytnij boki wkładek za pomocą obrotowego narzędzia wielofunkcyjnego z tarczą piły tarczowej lub piły ręcznej, aby utworzyć plastikowy pierścień o wysokości 2 mm z przymocowaną do niego przepuszczalną membraną.
3. Wypoleruj krawędzie tych minizbiorników skalpelem lub ostrym nożem.
4. Sterylizuj minizbiorniki w 70% etanolu przez co najmniej 1 godzinę.
5. Umyj minizbiorniki w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i pozwól im wyschnąć w okapie laminarnym.
6. Przepłukać minizbiorniki w PBS i pożywce hodowlanej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy/10% FBS/1% penicylina-streptomycyna).
7. Umieścić zbiornik na szalce Petriego, na kropli (600 μl/400 μl) pożywki hodowlanej, z membraną skierowaną do góry.
8. Wypreparowane ex vivo nerki embrionalne lub organoidy nerkowe ułożyć równomiernie na błonie za pomocą pipety lub szklanej rurki kapilarnej. Unikaj pozostawiania dużej ilości płynu wokół nerek.
9. Pozostawić próbki do membrany na 2–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   nuta: Na małej wkładce można umieścić do ośmiu embrionalnych nerek myszy E11.5 lub organoidów nerkowych. Duża wkładka jest zalecana, jeśli do ksenotransplantacji będą używane większe fragmenty tkanki embrionalnej lub mieszanina komórkowo-hydrożelowa na większej powierzchni CAM.
10. Z inkubatora do hodowli komórkowych należy wyjąć 8-dniowe kurczaki hodowane ex ovo w zarodkach przygotowanych zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami
11. Przenieś minizbiorniki do CAM tak, aby przeszczepy były skierowane w stronę CAM, a membrana je pokrywała. Umieść minizbiorniki na obrzeżach CAM tak, aby nie zakrywały zarodka kurczaka.
    nuta: W przypadku korzystania z mniejszych minizbiorników wykonanych z wkładek transwell do płytek 12-dołkowych, na jednym CAM można umieścić do trzech minizbiorników.
12. Dodać 500 μl (wkładka 6-dołkowa) lub 300 μl (wkładka 12-dołkowa) pożywki hodowlanej do minizbiorników.
13. Próbki należy hodować na CAM dla kurczaków przez maksymalnie 9 dni. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną w minizbiornikach.
    nuta: Unaczynienie próbek można zaobserwować już po 24–48 godzinach od przeszczepienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator komórkowy	Panasonic	13090543	Temperatura ustawiona na 37° C, 90% wilgotności, 5% CO₂
Inkubator komórkowy	SANYO SANYO (Organizacja Narod	10070347	Inkubator do hodowli kurczaków CAM. Temperatura ustawiona na 37° C, 90% wilgotności, 5% CO₂
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco	Sigma	Zobacz materiał D777	Wysoki poziom glukozy
Etanol (70%)	Firma VWR
Surowica bydlęca płodu	Klon HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Kleszcze DUMONT #5	Dumont	#5SF
Pbs-/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest (Zachód Biologi	Zobacz materiał X0520-500	Mycie mini zbiorników.
Penicylina i streptomycyna	Sigma	Zobacz materiał P4333
Thincert 12-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych z membraną polistyrenową o porach 0,4 μm	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-dołkowe wkładki do hodowli komórkowych z membraną polistyrenową o porach 0,4 μm	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 657610

powiedział: