Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Law, V. et al. A Mysi model ksenoprzeszczepu Ommaya do badania bezpośredniej terapii choroby opon mózgowo-rdzeniowych. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Montaż i implantacja Mysiego Ommaya

1. Przygotowanie stacji
   1. Zdezynfekuj powierzchnię stacji. Umieść niebieską powłokę na powierzchni i przygotuj wszystkie wysterylizowane narzędzia i materiały eksploatacyjne wskazane na rysunku 1.
2. Zabieg przedoperacyjny
   1. Zastosuj środek przeciwbólowy (Bup-SR) i utrzymuj sterylne środowisko chirurgiczne.
3. Chirurgiczne wszczepienie implantu mysiego Ommaya
   1. Zmontuj urządzenie do wstrzykiwań Murine Ommaya za pomocą miniaturowego portu iniekcyjnego 25 G (średnica zewnętrzna 0,51 mm) i krążka dystansowego 1 mm. Użyj sterylnego kleju cyjanoakrylowego, aby zapewnić penetrację około 2,5 mm metalowej kaniuli do prawej półkuli mózgowia (ryc. 2A–C).
      nuta: W tym laboratorium opracowano prototyp myszy Ommaya kompatybilny z rezonansem magnetycznym, w którym obie części (miniaturowy port wtryskowy i przekładka) są już wydrukowane w 3D jako jedna jednostka (rysunek 2D). Wersja z pojedynczym urządzeniem została przetestowana za pomocą rezonansu magnetycznego i może zaoszczędzić czas, eliminując etap montażu.
   2. Znieczulij mysz 2-3% izofluranem, aż nie pojawią się oznaki odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić stan znieczulenia.
   3. Ogolić całą brzuszną powierzchnię głowy futra i przygotować skórę zgodnie z techniką sterylną. Umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym ze stożkiem nosowym, aby kontynuować podawanie izofluranu podczas zabiegu; Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5%. Delikatnie dokręć nauszniki, aby zabezpieczyć głowę i nałóż smar do oczu, aby zakryć oczy myszy.
   4. Wykonaj małe nacięcie skóry (3 mm), a następnie rozwarstwienie leżących poniżej tkanek podskórnych, aby odsłonić czaszkę. Osusz czaszkę za pomocą aplikatora w sztyfcie nasączonego wodą wodorową z bawełnianą końcówką.
   5. Wywierć otwór w czaszce 0,5 mm z tyłu i 1,1 mm z boku bregmy - anatomicznego punktu na czaszce, w którym szew koronalny przecina prostopadle szew strzałkowy (ryc. 2A), a także otwór w kształcie zadzioru 0,9 mm, aby odsłonić oponę twardą. Odsuń mikrowiertło na bok i delikatnie naciąć kość bezpośrednio otaczającą otwór zadziorowy przed włożeniem portu iniekcyjnego (głębokość około 2,5 mm), przymocowanego do czaszki za pomocą sterylnego kleju cyjanoakrylowego. Skonfiguruj szew wokół miejsca wstrzyknięcia za pomocą nylonowych szwów 4-0 o nienasiąkliwości w przerywanym wzorze ściegu lub szwu sznurkowym torebki.
   6. Trzymanie myszy pooperacyjnych w indywidualnych klatkach do rekonwalescencji po operacji.
      nuta: Możliwe, że mysia Ommaya może odpaść, gdy wiele myszy wyleczonych po operacji jest trzymanych w tej samej klatce, prawdopodobnie z powodu ciągłych interakcji manipulacyjnych. Zaleca się, aby myszy z implantami Murine Ommaya były trzymane pojedynczo (lub nie więcej niż 2 myszy w klatce) w trakcie badania skuteczności leku.

2. Leczenie Mysiej Ommayi

1. Dawkowanie myszy za pomocą mysiego Ommaya
   1. Znieczulenie myszy 2-3% izofluranem, aż nie pojawią się oznaki odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby potwierdzić utrzymanie znieczulenia.
   2. Uzyskaj dostęp do Mysiej Ommayi za pomocą adaptera do wstrzykiwań z portem i strzykawki Hamiltona. Za pomocą kleszczyków przytrzymaj górną część miniaturowego portu iniekcyjnego i delikatnie włóż adapter wtryskiwacza portu całkowicie do przegrody portu.
      nuta: Wtryskiwacz portu przebija przegrodę portu w sposób, który zmniejsza martwą przestrzeń do minimum i umożliwia kontrolowane wstrzykiwanie za pomocą zmotoryzowanej pompy strzykawkowej (rysunek 3A). Ukierunkowane/nowatorskie terapie są wstrzykiwane z szybkością przepływu 1 μl/min w znieczuleniu. Leczenie należy podawać w określonych odstępach czasu (codziennie/co tydzień) przez określony czas (tygodnie/miesiące), zgodnie z uznaniem badacza.
      Optymalna jest objętość od 3 do 7 μl, ponieważ objętość <3 μl jest zawodna, a objętość >7 μl może powodować zbyt duże ciśnienie. Wielkość strzykawki Hamilton może wynosić od 10 do 100 μl, w zależności od liczby myszy w każdym ramieniu leczenia. Wstępne załadowanie odpowiedniej objętości do strzykawki Hamilton zapobiegnie wielokrotnej wymianie strzykawki, minimalizując w ten sposób błędy. Najlepiej jest przeznaczyć 1 strzykawkę Hamiltona na ramię zabiegowe.
   3. Po wykonaniu wstrzyknięcia odłącz mysz Ommaya od adaptera do wstrzykiwań z portem za pomocą kleszczy i umieść mysz z powrotem w klatce, aby doszła do siebie po znieczuleniu.

Wyniki

Rysunek 1: Przykład stanowiska pracy do wykonywania implantacji Mysiej Ommayi u myszy. (1) Aparat do znieczulania gazem/parownik. (2) Sterylna niebieska zasłona papierowa pokrywająca stojak stereotaktyczny. (3) Urządzenie stereotaktyczne (stojak/scena, nauszniki, stożek nosowy). (4) Mikrowiertło. (5) Szkło powiększające ze światłem. (6) Sterylny aplikator w sztyfcie z bawełnianą końcówką ze sterylnym pojemnikiem do płukania soli fizjologicznej. (7) Nad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tarcza dystansowa 1 mm	Alzet, Korporacja Durect	#0008670	Tylko tarcza dystansowa
Szew nylonowy 4-0 ethilon	Dowolny dostawca
Automatyczne pompy strzykawkowe	Pompy strzykawkowe Harvard (lub dowolny dostawca)	Numer katalogowy #70-4505	Pompa 11 Elite
Sterylizator koralików	Braintree Scientific Inc. (lub dowolny dostawca)	#GER 5287-120V	Kiełkownik 500
Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu (Bup-SR)	Zoopharm		Kontrolowane przez DEA
Sterylny klej cyjanoakrylowy	Dowolny dostawca
System anestehzji do inhalacji gazowej	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Strzykawki Hamilton w mikrolitrach	Hamilton		10, 25, 50 i 100 μl; 30G do wstrzykiwań cisterna magna
Nadtlenek wodoru	Dowolny dostawca
System obrazowania IVIS 200	Suwmiarka Nauki przyrodnicze
Szkło powiększające ze światłem	Dowolny dostawca
Mikrowiertło	Stoelting (lub dowolny dostawca)	#51555M
Obrazowanie MRI	Bruker	Seria BioSpec	fakultatywny
Prototyp Mysi Ommaya (kompatybilny z MRI)	Instech Laboratories, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
Wtryskiwacz PinPort	Instech Laboratories, Inc.	#PNP3M-50
Złącze PinPort	Instech Laboratories, Inc.	#1-PNP3F28-50
Narzędzia chirurgiczne dla gryzoni (nożyczki, kleszcze)	Instrument chirurgiczny Roboz (lub dowolny dostawca)
Urządzenie stereotaktyczne	Stoelting (lub dowolny dostawca)	#51730M
Sterylny niebieski papier / zasłona	Dowolny dostawca
Sterylne patyczki bawełniane	Dowolny dostawca

powiedział: