Izolacja jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka: metoda uzyskiwania nienaruszonych jąder z próbek guza glejaka

Streszczenie

Źródło: Narayanan, A. i inni. Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje protokół izolacji pojedynczych jąder ze świeżo zamrożonej tkanki glejaka. Wyizolowane pojedyncze jądra mogą być wykorzystane jako próbki do technik sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA) i test pojedynczych jąder do sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (snATAC) w celu uzyskania głębszego wglądu w niejednorodność między- i wewnątrznowotworową obserwowaną w glejaku ośrodkowych tkanek nerwowych.

Protokół

1. Tkanka Rozwarstwienie i dysocjacja

1. Przenieść świeżo zamrożoną próbkę tkanki (10–60 mg) na wstępnie schłodzoną szalkę Petriego. Świeżo zamrożoną tkankę zmielić/posiekać żyletką na małe kawałki na lodzie.
2. Dodać 500 μl schłodzonego buforu do lizy jąder do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść kawałki tkanki w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor do lizy jąder i przenieś do Douncera (Tabela materiałów).
   UWAGA: Istnieją dwa tłuczki homogenizatora Dounce: "luźny" lub "A" do początkowej redukcji próbki i "ciasny" lub "B" do pełnej homogenizacji próbki.
3. Odbijaj kawałki tkanki "luźnym" tłuczkiem przez około 20 uderzeń, aż tarcie zostanie zmniejszone. Jeżeli obecne są zanieczyszczenia, próbkę można wstępnie oczyścić przez filtrację za pomocą sitka o średnicy 100 mm.
4. Odbijaj "ciasnym" tłuczkiem przez 20 uderzeń, aby uzyskać pełną homogenizację tkanek.
5. Przenieść homogenat (około 500 μl) do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml schłodzonego buforu do lizy. Delikatnie wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 5 minut. Delikatnie wymieszać końcówką do pipet o szerokim otworze i powtórzyć 1-2 razy podczas inkubacji.
6. Przefiltrować cały homogenat za pomocą siatki sitowej o wielkości 30 μm, zebrać do probówki Falcon o pojemności 15 ml i przenieść z powrotem do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml. Pojedyncze sitko jest zazwyczaj wystarczające dla całego homogenatu.
7. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona. Jeśli szczątki są obecne, jądra mogą być ponownie filtrowane.
8. Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C na wirówce stołowej. Usunąć supernatant, pozostawiając ~50 μL z osadem zawierającym jądra. Delikatnie zawiesić osad w kolejnym 1 ml buforu do lizy jąder i inkubować przez 5 minut na lodzie.
9. Odwirować jądra w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, dodać 500 ml 1x buforu homogenizacyjnego (HB) (Tabela 1) i inkubować przez 5 minut bez ponownego zawieszania. Następnie ponownie zawieś jądra w kolejnym 1,0 ml 1x HB.
10. Odwirować jądra w temperaturze 500 x g g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić jądra w 200 μl 1x HB w nowej probówce o pojemności 2,0 ml.

    Tabela 1: Przygotowanie 1x niestabilnego roztworu buforu homogenizacyjnego (2 ml na próbkę)

    1x Niestabilny roztwór buforu homogenizacyjnego (2 ml na próbkę)
    Odczynnik	Końcowa koncentracja.	Objętość na próbkę (μL)
    6x Bufor homogenizacyjny niestabilny	1x	333.33
    1 M Sacharoza	320 mM	640.00
    50 mM EDTA	0.1 mM	4.00
    10% NP40	0.1%	20.00
    H2O		1006.27

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Sigma	M6250
CaCl2	Sigma	21115-100ML
EDTA (0,5 M)	Thermo Scientific	R1021
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml	Fisher Scientific	352096
MACS SmartStrainers (100 &mikro; m)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Mg(Ac)2	Sigma	63052-100ML
NP-40	Biblioteka	ab142227
Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ Prep	Sigma	NUC101-1KT
Bezpieczne rurki blokujące 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Bezpieczne rurki zamka 2,0 mL	Eppendorf	30120094
Sacharoza	Sigma	S0389
Końcówki do pipet o szerokim otworze (1000 &mikro; L)	Themo Fisher Naukowy	2079GPK