$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wirowanie gradientowe
- Dodać 200 μl 50% roztworu jodiksanolu (tabela 1), aby uzyskać końcowe stężenie 25% jodiksanolu. Dobrze wymieszać 10 razy pipetą ustawioną na 300 ml.
- Dodać 300 μl 29% roztworu jodiksanolu (tabela 2) pod 25% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw.
- Dodać 300 μl 35% roztworu jodiksanolu (Tabela 3) pod 29% mieszaninę. Użyj cienkiej końcówki P1000, aby uniknąć mieszania się warstw.
ostrożność: Ten etap wymaga stopniowego zdejmowania końcówki pipety podczas pipetowania, aby uniknąć nadmiernego przemieszczania objętości.
- Umieścić próbki w wirówce z odchylanym wiadrem, wirować przez 20 minut w temperaturze 3 500 x g w temperaturze 4°C przy wyłączonym hamulcu.
- Delikatnie usunąć próbki bez wstrząsania i obserwować pod światłem. Między drugą a trzecią warstwą powinien być widoczny wyraźny biały pas jąder o czystości 95% (ryc. 1).
2. Izolacja jąder
- Odessać górne warstwy aż do białego pasma jąder na interfazie 29%–35%.
- Zebrać pasmo jąder w objętości 200 ml, przenieść do świeżej probówki i przefiltrować za pomocą filtra 20 μm (tabela materiałów).
nuta: Jądra nie muszą być ponownie zawieszane przed filtracją.
- Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zweryfikować usunięcie dużych zanieczyszczeń i nienaruszoną membranę jądrową. Jądra muszą być okrągłe, a błona jądrowa nie powinna być zniekształcona.
- Policz jądra za pomocą barwienia błękitem trypanowym na hemocytometrze i podwielokrotne jądra dla snRNA-seq/snATAC-seq.
Tabela 1: Przygotowanie 6x buforu homogenizacyjnego Stable Master Mix
pkt.
| 6x Bufor homogenizacyjny Stabilny Master Mix |
| Odczynnik | Końcowa konc. | Objętość dla 100 (mL) |
| 1 M CaCl₂ | 30 mM | Wersja 3.0 |
| 1 M Mg(Ac)₂ | 18 mM | 1.8 |
| 1 M Tris pH 7,8 | 60 mM | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Przechowywać w temperaturze pokojowej, unikać bezpośredniego wystawienia na działanie światła |
Tabela 2: Przygotowanie 1 M sacharozy
| 1 M sacharozy |
| 34,23 g sacharozy |
| Rozpuścić w 78,5 ml wody |
| Napełnij wodą do 100 ml |
Tabela 3: Przygotowanie 6 niestabilnych roztworów buforu homogenizacyjnego (650 μl na próbkę)
pkt.
| 6x Niestabilny roztwór buforu homogenizacyjnego (650 ml na próbkę) |
| Odczynnik | Końcowa konc. | Objętość na próbkę (μl) |
| 6x Stabilny bufor homogenizacyjny | 6-krotnie | 648,84 pkt. |
| 100 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) | 0,1 mM | Klasa 1,08 |
| 14,3 M β-merkaptoetanol | 1 mM | 0,08 |
