Kriokonserwacja mózgu myszy przez szybkie zamrażanie: technika szybkiego zamrażania całej próbki mózgu myszy do analizy histologicznej

Streszczenie

Źródło: Comba, A. et al. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji podregionów glejaka w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje kriokonserwację mózgu myszy w celu odizolowania dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych populacji komórek z tkanek nowotworowych. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnej rozdzielczości optycznej morfologii tkanki mózgowej do późniejszej analizy.

Protokół

1. Kriokonserwacja mózgów, w których znajdują się guzy glejaka

1. Przed krioprezerwacją mózgów przygotuj słoik wypełniony zimnym izopentanem/2-metylobutanem i umieść go w pojemniku wypełnionym ciekłym azotem. Poczekaj, aż rozpuszczalnik ostygnie.
2. Wyjmij mózg z 30% roztworu sacharozy i osusz go na bibule filtracyjnej.
3. Oznacz kriomold trwałym markerem. Ostrożnie dodaj około 5 ml OCT (związku o optymalnej temperaturze cięcia) do środka kriomoldu, unikając pęcherzyków powietrza.
4. Umieść mózg w kriomold zawierającym OCT w żądanej orientacji. Napełnij formę OCT, aż mózg zostanie całkowicie zanurzony. Używając czystych kleszczy, szybko umieść kriomold z OCT i mózg w zimnym izopentanie/2-metylobutanie.
5. Gdy OCT zastygnie (~30–40 s), wyjmij krioform z mózgiem i umieść go w suchym lodzie. Nie pozostawiaj formy zawierającej mózg w 2-metylobutanie dłużej niż 2 minuty, ponieważ może to spowodować pęknięcia w stałym OCT. Owiń kriomold wraz z mózgiem w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze -80 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odklej jednorazowe formy do osadzania	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 70182
Kriostat badawczy	Księga Leica	CM3050s powiedział:
Związek Tissue-Plus OCT	Fisher Naukowy	23-730-571