Sekcja zamrożonej tkanki mózgowej myszy: procedura uzyskiwania cienkich zamrożonych skrawków tkanki z zamrożonej tkanki mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Comba, A. et al. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji podregionów glejaka w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie pokazujemy cięcie zamrożonej tkanki guza mózgu myszy za pomocą kriostatu. Uzyskane w ten sposób zamrożone skrawki tkanki mózgowej są przechowywane w niskich temperaturach do czasu dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Cięcie zamrożonych tkanek guza mózgu

1. Oznaczyć szkiełka z 2 μm polietylenu naftalanowego (PEN) informacjami o próbce. Skrawki tkanek zostaną umieszczone bezpośrednio na tych szkiełkach po przecięciu.
2. Ustawić temperaturę w komorze kriostatu w zakresie od -20 do -24 °C. Przed podziałem na sekcje umieścić blok próbki w komorze kriostatu i pozostawić go do wyrównania do temperatury w komorze przez 30–60 minut.
3. Wyczyść komorę kriostatu i uchwyt noża 100% etanolem i spryskaj szczotki, które mają być używane, roztworem czyszczącym RNazy. Pracując w komorze kriostatu, usuń formę i przymocuj blok OCT zawierający mózg do dysku próbki kriostatu za pomocą OCT. Umieść blok w uchwycie dysku i wyrównaj blok z ostrzem noża.
4. Zamontuj jednorazowe ostrze w uchwycie do sekcji.
5. Przekrój mózg na grubość 10 μm. Upewnij się, że w chusteczce nie ma smug ani zadrapań. Za pomocą pędzla ostrożnie spłaszcz i rozwiń chusteczkę na powierzchni cięcia.
6. Ostrożnie zamontuj tkankę zawierającą sekcje mózgu na szkiełkach PEN wolnych od RNaz. Odwróć dodatnio naładowane szkiełka palcami w kierunku tkanki i płynnie dociśnij szkiełko w dół w kierunku sekcji tkanki.
   nuta: Temperatura dłoni pomoże chusteczce przyczepić się do szkła.
7. Po zamontowaniu skrawków mózgu na szkiełkach, należy przechowywać szkiełka w pudełku wewnątrz komory kriostatu, a następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C. Nigdy nie przechowuj szkiełek w temperaturze pokojowej.
   nuta: Fałdowanie tkanki i rozdarcie są powszechne. Aby uzyskać dokładną analizę a posteriori, ważne jest, aby zminimalizować te artefakty.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełko szklane z membraną PEN (2 μm)	Lieca	1150518
Kriostat badawczy	Księga Leica	CM3050s powiedział:
Roztwór do odkażania RNazaz RNaseZap	Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9780
Odklej jednorazowe formy do osadzania	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 70182
Rozwiązanie Pinpoint	Badania Zymo	D3001-1
Związek Tissue-Plus OCT	Fisher Naukowy	23-730-571