Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Utrwalanie i barwienie kriokonserwowanych skrawków tkanki mózgowej
- Aby zachować integralność RNA, wyczyść wszystkie używane instrumenty roztworem czyszczącym RNaza. Postępuj zgodnie z protokołem utrwalania i barwienia wewnątrz dygestoria.
- Przygotować opisane roztwory utrwalające w czystych, wolnych od RNaz probówkach o pojemności 50 ml. Wszystkie roztwory należy przygotować wodą wolną od RNaz w dniu barwienia.
- Tego samego dnia zostanie wykonana mikrodysekcja laserowa, w której zostaną przygotowane roztwory 100%, 95%, 70% i 50% etanolu. Roztwory należy przechowywać w szczelnie zamkniętych tubkach w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 4% fioletu krezylowego i 0,5% eozyny Y w 75% roztworze etanolu. Energicznie wirować roztwór przez 1 minutę i przefiltrować je przez filtr nylonowy 0,45 μm, aby wyeliminować ślady nierozpuszczonego proszku.
- Umieść szkiełka tkankowe w pojemniku z 95% etanolem na 30 sekund. Przenieś szkiełka do rurki zawierającej 75% etanolu; pozostaw tam szkiełka na 30 sekund.
- Przenieś szkiełka do 50% etanolu i pozostaw je tam na 25 sekund. W tym momencie KTZ zostanie rozwiązany. Przenieść szkiełko do 4% roztworu fioletu krezylowego na 20 s, a następnie przenieść do 0,5% roztworu eozyny Y na 5 s.
- Wyjmij szkiełko z roztworu barwnika i osusz szkiełko bibułą filtracyjną. Następnie umieść szkiełka w 50% etanolu na 25 s. Przenieś szkiełka do 75% etanolu na 25 s. Przenieś szkiełka do 95% etanolu na 30 s. Przenieś szkiełka do 100% etanolu na 60 s.
- Przepłukać szkiełko ksylenem. Przełóż je do pojemnika z ksylenem i odczekaj 3 minuty.
- Przygotuj podłoże montażowe (np. gumę Pinpoint) w wodzie wolnej od RNaz. Aby zamontować sekcje mózgu myszy, rozcieńczyć podłoże mocujące w wodzie wolnej od RNaz w stosunku 1:10.
- Suszyć szkiełka na powierzchni wolnej od RNaz w temperaturze pokojowej przez 10 s. Zanim ksylen wyschnie, przystąp do montażu szkiełek z sekcjami tkanki.
- Delikatnie rozprowadź roztwór montażowy na wierzchu tkanki na szkiełku za pomocą sterylnego i wolnego od RNaz cienkiego pędzla. Odczekaj 10–20 sekund, a następnie natychmiast przenieś szkiełka tkankowe na platformę mikrodysekcji mikroskopu.
UWAGA: Stosunek podłoża montażowego do wody wolnej od RNaz użytej do montażu różni się w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Stosunek podłoża montażowego do wody zachowuje morfologię tkanki glejaka do mikrodysekcji laserowej bez wpływu na integralność RNA.
