$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki z mózgu
- Rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości w stosunku 9:1 z PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać końcowy 100% roztwór.
- Znieczulenie myszy w szczycie EAE za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu (50 mg / kg) i perfuzję dosercową za pomocą 20 ml sterylnego, lodowatego PBS. Osiągnij to, powoli i równomiernie wstrzykując PBS do lewej komory serca za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i otwierając prawy przedsionek.
- Ostrożnie przeciąć czaszkę od nosa do szyi, a następnie wyjąć mózg z pudełka czaszkowego do 10 ml RPMI w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, aby usunąć przylegające czerwone krwinki. Następnie usuń pożywkę przez aspirację i dodaj 10 ml RPMI.
- Umieść mózgi i podłoże w naczyniu o średnicy 100 mm. Drobno posiekaj żyletką.
- Przenieś 6 ml z naczynia do lodowatego homogenizatora ze szkła spiekanego o pojemności 7 ml za pomocą czystej pipety. Unikaj pozostawiania dużych ilości tkanki w pipecie. Niewielka ilość jest nieunikniona.
- Najpierw zmielić mózg za pomocą "luźnego" tłoka tłuczka, następnie użyć "ciasnego" tłoka, aż zawiesina stanie się jednorodna i przelać do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i trzymać na lodzie.
- Po homogenizacji wszystkich próbek oszacuj objętość. Dostosuj głośność za pomocą RPMI do 7 ml. Następnie umieść 3 ml lodowatej 100% macierzy membranowej w schłodzonej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj 7 ml homogenatu mózgu, aby uzyskać końcowe podłoże o gradiencie gęstości 30%. Wymieszaj kilka razy przez odwrócenie. Nie wirować.
- Aby zapewnić ostre interfejsy, ostrożnie i powoli dodawaj 1 ml podłoża o gradicynie gęstości podkładu o 70% w RPMI za pomocą pipety o pojemności 3 ml.
- Wirować przy 800 x g tylko przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić przyspieszenie na 1, a opóźnienie na 0. Po odwirowaniu odessać prawie całą górną fazę, uważając, aby całkowicie usunąć mielinę na górze (ryc. 1).
- Wyjmij interfejs do nowej probówki wirówkowej 15. Dostosuj objętość do 10 ml za pomocą RPMI.
- Wirować przy 500 x g przez 10 min. Po odwirowaniu odessać supernatant. Zawiesić osad w ~200 μL buforu do barwienia cytometrią przepływową (FSC).
