Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Streszczenie

Źródło: Bezstarosti, K. et al. Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Protokół

1. Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych

1. Użyć chromatografii C18 o wysokim pH z fazami odwróconymi (RP) z polimerowym materiałem fazy stacjonarnej (300 A, 50 μM; patrz Tabela Materiałów) załadowanym do pustego wkładu kolumnowego w celu frakcjonowania peptydów tryptycznych. Wielkość złoża fazy stacjonarnej musi być dostosowana do ilości trawionego białka, które ma być frakcjonowane. Przygotować pusty wkład kolumnowy o pojemności 6 ml (patrz Tabela materiałów) wypełniony 0,5 g materiału fazy stacjonarnej na ~10 mg trawienia białka. Stosunek trawienia białka do fazy stacjonarnej powinien wynosić około 1:50 (w/w).
2. Załadować peptydy do przygotowanej kolumny i przemyć kolumnę około 10 objętościami kolumny 0,1% TFA, a następnie około 10 objętościami kolumny H2O.
3. Rozpuść peptydy na trzy frakcje z 10 objętościami kolumn 10 mM roztworu mrówczanu amonu (pH = 10) z odpowiednio 7%, 13,5% i 50% acetonitrylu (AcN). Liofilizuj wszystkie frakcje do kompletności.
4. Użyj przeciwciał przeciwko motywowi resztki ubikwityny (K-ε-GG) sprzężonych z kulkami agarozowymi białka A w celu wzbogacenia immunologicznego peptydów diGly. Ponieważ dokładna ilość przeciwciał w partii kulek jest informacją zastrzeżoną i nie jest ujawniana przez producenta, zaleca się stosowanie tej samej definicji dla partii kulek, co producent, aby uniknąć nieporozumień. Umyj jedną partię tych kulek 2x PBS i podziel zawiesinę kulki na sześć równych frakcji. Na rysunku 1 przedstawiono szczegółowy schemat eksperymentalny.
5. Rozpuść trzy frakcje peptydowe zebrane w kroku 1.3 w 1,4 ml buforu składającego się z 50 mM MOPS, 10 mM fosforanu sodu i 50 mM NaCl (pH = 7,2) i odwiruj szczątki.
6. Dodać supernatanty frakcji do kulek przeciwciała dwupoziomowego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na rotatorze. Odwirować kulki i przenieść supernatant do świeżej partii kulek przeciwciał i ponownie inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Przechowuj supernatanty do późniejszej globalnej analizy proteomu (GP).
8. Przenieś kulki z każdej frakcji do końcówki do pipety o pojemności 200 μl wyposażonej w zatyczkę filtrującą GF/F, która zatrzymuje kulki. Umieść końcówkę pipety z koralikami w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wyposażonej w adapter końcówki wirówki. Przemyć kulki 3x 200 μl lodowatego buforu IAP, a następnie 3x 200 μl lodowatego Milli-Q_{H 2}O. Wirować kolumnę przy 200 x g przez 2 minuty przed każdym etapem mycia, ale należy uważać, aby kolumna nie wyschła. Eluować peptydy za pomocą 2 cykli po 50 μl 0,15% TFA.
9. Odsolić peptydy za pomocą końcówki do stopniowania C18 (zasadniczo końcówki pipety o pojemności 200 μl z dwoma krążkami C18) i wysuszyć je do pełnej konsystencji za pomocą wirowania próżniowego.

Wyniki

Rysunek 1: Przegląd eksperymentalny.(A) Przegląd podejścia eksperymentalnego. Próbki przygotowano, wytrypsynowano i frakcjonowano na trzy frakcje za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami z elucją. Jedną partię komercyjnych kulek przeciwciała peptydowego α-diGly podzielono na sześć równych frakcji, a następnie trzy frakcje peptydowe załadowano na trzy frakcje kulek. Peptydy diGly zostały oczyszczone immunologicznie, eluowane i zebr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Endopeptydaza lizylowa (LysC)	Wako Pure Chemicals (Czysta Chemia Wako	Numer katalogowy: 129-02541
Piec NanoLC	Projektowanie MPI, MS Wil GmbH
Sól sodowa N-lauroilosarkozyny	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos masa spektrometr	Rybak termiczny
PLRP-S (300 A, 50 μm) polimerowy cząstki o odwróconej fazie	Technologie Agilent	PL1412-2K01
PTMScan Motyw pozostałości ubikwityny (K-ε-GG) Zestaw	Technologie sygnalizacji komórkowej	5562
Sep-Pak tC18 Wkład próżniowy o pojemności 6 cm3	Wody	WAT036790	Usuń materiał tC18 z Wkład przed napełnieniem Cartridge z PLRP-S
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 30970
Podstawa Tris	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T5941
Trypsyna, poddana działaniu TPCK	Rybak termiczny	20233