Test syntezy DNA: technika oceny syntezy DNA w proliferujących komórkach przy użyciu radioaktywnej tritacji tymidyny

Streszczenie

Źródło: Williams, M. et al. Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC). J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie określamy zdolność proliferacyjną neuronalnych komórek progenitorowych, mierząc inkorporację radioaktywnego znacznika tritiowanego tymidyny do DNA komórek. Technika ta może być stosowana do badania proliferacji komórek po leczeniu niektórymi lekami i czynnikami wzrostu.

Protokół

1. Utrzymanie NPC

1. Umieść NPC o gęstości 1,5 miliona komórek w studzience pokrytej żelem naśladującym ECM, zawierającej 2 ml 100% podłoża ekspandacyjnego.
2. Inkubować NPC w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO_{2 .}
3. Dodaj 5 μM inhibitora ROCK do pożywki dla NPC o stężeniu P3 lub niższym lub dla rozmrożonych NPC, aby zapobiec nadmiernej śmierci komórek. Zmień podłoże po 24 godzinach, aby usunąć inhibitor ROCK.
4. Komórki pasażują co 4–9 dni, w zależności od tego, kiedy zaczynają się zlewać. Komórki uważa się za zlewające się, gdy stają się gęsto upakowaną monowarstwą pokrywającą całe dno powierzchni naczynia.
5. Płytkie NPC o gęstości od 1 do 1,5 miliona komórek na jeden dołek na płytce 6-dołkowej. Usuwaj zużyte nośniki co 48 godzin i zastąp je 2 ml 100% nośnika rozszerzającego.

3. Test syntezy DNA neuronalnych komórek prekursorowych

1. Umieść 100 000 komórek / basenie na 24-dołkowej płytce i oceń w trzech egzemplarzach/warunkach.
2. Dodać radioaktywną, trytytowaną [³H]-tymidynę do pożywki hodowlanej (1,5 μCi/ml) w każdym dołku po 46 godzinach w hodowli. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 h.
   nuta: W przypadku korzystania z materiałów promieniotwórczych należy przejść szkolenie w swojej instytucji, przestrzegać protokołów bezpieczeństwa radioaktywnego i utylizować materiały radioaktywne w odpowiednio wyznaczonych pojemnikach na odpady.
3. Po 2 godzinach usunąć i odpowiednio zutylizować pożywki radioaktywne. Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA (0,5 mM) do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
4. Włącz kombajn do ogniw (patrz rozdział Materiały) i pompę i upewnij się, że ciśnienie pompy jest poniżej 200 PSI. Umieść bibułę filtracyjną w przestrzeni w kombajnie kombajnowym i oderwij prawy róg, aby zaznaczyć orientację papieru.
5. Umieść rurki zbiorcze kombajnu komórkowego w pustej "czystej" tacy i naciśnij pranie wstępne, aby zwilżyć bibułę filtracyjną. Umieścić probówki zbiorcze w dołkach na próbki i uruchomić (rozpocząć).
6. Gdy kombajn komórkowy zakończy pobieranie próbek, podnieś zacisk i przesuń bibułę filtracyjną, aby powtórzyć tę czynność dla wszystkich zestawów próbek. Zawsze pierz wstępnie na pustym, "pustym" talerzu.
7. Wysuszyć bibułę filtracyjną pod źródłem światła i umieścić odpowiednie fiolki na tacy. Wybij papierowe płytki do fiolek i dodaj 2 ml płynnego koktajlu scyntylacyjnego do każdej fiolki. Fiolki z nakrętką i etykietą.
8. Inkubować fiolki w płynnym koktajlu scyntylacyjnym przez co najmniej 1 godzinę przed odczytaniem liczby na minutę (CPM) na maszynie scyntylacyjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowany DMEM/F12 Średni	Naukowy ThermoFischer	Numer katalogowy: 12634-010	Składnik 100% medium rozszerzającego
Podłoże nerwowo-podstawowe	Naukowy ThermoFischer	21103049
Płytki 24-dołkowe	Naukowy ThermoFischer	2021-05	Płytki polistyrenowe: Używane do oznaczania syntezy DNA NPC
Naturalna mysz Laminin	Invitrogen	23017-015	Podłoże do powlekania płytek: Używane do syntezy DNA NPC, wprowadzania fazy S i oznaczania liczby komórek
Penicylina/Streptomycyna	Naukowy ThermoFischer	15140122	Antybiotyk, składnik pożywek ekspandujących
2,5% trypsyna (10X)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15090-046	10X roztwór enzymatyczny
0,5 mln EDTA	Naukowy ThermoFischer	AM9261	Stosowany w roztworze trypsyny do podnoszenia komórek do testu syntezy DNA
trytyowana [3H]-tymidyna	PerkinElmer powiedział:	NET027E001	Tryt radioaktywny, tymidyna
Fiolki scyntylacyjne Fisherbrand 7 ml HDPE	Marka rybacka	03-337-1	Fiolki do zliczania cieczy scyntylacyjnych
EkoLite(+)	MP Biomedycyna	188247501	Płynny koktajl scyntylacyjny
LS 6500 wielofunkcyjny licznik scyntylacyjny cieczy	Beckman Coulter	8043-30-1194	Licznik scyntylacyjny cieczy
Skatron Półautomatyczny kombajn komórkowy	Urządzenia molekularne i Skatron Instruments, Inc.	Typ 11019	Półautomatyczny kombajn komórkowy
Bibuła filtracyjna klasy GF/C, Whatman	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	Lata 1822-849	Bibuła filtracyjna z włókna szklanego

powiedział: