Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Williams, M. et al. Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC).J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Protokół

1. Test migracji neurosfery NPC

Powstawanie neurosfery
1. Dodaj 1 ml 100% podłoża rozprężnego do naczynia o średnicy 35 mm bez podłoża powlekającego. Inkubować szalki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C przed posiewem NPC. Przygotuj 2-3 szalki, aby upewnić się, że będzie wystarczająco dużo neurosfer do testu migracji komórek.
  nuta: Brak podłoża powlekającego zapewnia, że NPC pozostają zawieszone w pożywce, co jest niezbędne do tworzenia neurosfery. Powlekanie naczyń zapobiegnie tworzeniu się neurosfery.
2. Podnoszenie, dysocjacja i granulowanie komórek. Zawieś osad komórkowy w 2–5 ml wstępnie podgrzanego 100% podłoża rozszerzającego. Umieść 1 milion NPC w każdej 35-milimetrowej czaszy przygotowanej w sekcji 1.1.1.
3. Inkubuj NPC w temperaturze 37 °C przez 48 do 96 godzin, aby umożliwić NPC agregację i tworzenie neurosfer. Oceń rozmiar kuli za pomocą linijki na żywo w mikroskopie z kontrastem fazowym. Poczekaj, aż większość kul osiągnie przybliżoną średnicę 100 μm (± 20 μm) (rysunek 1). Mniejsze kule całkowicie rozproszą się i rozpadną podczas testu migracji.
Przygotowanie płytek do oznaczania migracji neurosfery
1. Rozpuść podwielokrotności żelu naśladującego ECM w 6 ml 30% pożywki ekspancyjnej. Po przygotowaniu roztworu żelu naśladującego ECM/30% podłoża rozprężnego, dodaj nośniki, czynniki wzrostu lub leki o pożądanych stężeniach.
  nuta: Stężenia nośnika, leku i czynnika wzrostu należy zwiększyć, aby uwzględnić dodanie 200 μl neurosfer w sekcji 1.3.
2. Płytka 1 ml żelu naśladującego ECM / 30% roztworu pożywki ekspancyjnej (± nośniki, czynniki wzrostu lub leki) do jednego dołka na płytce 6-dołkowej. Wykonaj 2-3 studzienki na warunki eksperymentalne. Alternatywnie można użyć szalek o średnicy 35 mm. Inkubować płytki przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C^.
  nuta: NIE WOLNO zasysać roztworu żelu naśladującego ECM/30% pożywki ekspansacyjnej do tego testu. Powlekanie kulek na zasysanym żelu ECM-Mimic doprowadzi do szybkiej i nadmiernej migracji.
Poszycie neurosfer
1. Zbierz neurosfery utworzone w sekcji 1.1 i umieść je w stożkowej rurce. Umyj naczynia o średnicy 35 mm 1 ml 1x PBS, aby upewnić się, że wszystkie neurosfery zostały zebrane. Obracaj zebrane neurosfery w tempie 100 x g przez 5 minut.
2. Ponownie zawiesić neurosfery w 1-3 ml wstępnie podgrzanego 30% podłoża ekspansywnego. Jeśli zbierze się 1 miskę neurosfer, 1 ml pożywki jest używany do ponownego zawieszenia kulek. Jeśli zostaną zebrane 2 szalki, dodaje się 2 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia kulek itp. Delikatnie pipetuj i używaj tylko P-1000, aby upewnić się, że kulki nie są uszkodzone.
3. Wprowadzić 200 μl zawieszonych neurosfer do żelu naśladującego ECM/30% roztworu rozprężającego wykonanego w sekcji 1.2. Płyty skalne we wszystkich kierunkach, aby równomiernie rozprowadzić neurosfery. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37°C.
4. Usuń żel naśladujący ECM/30% roztwór podłoża eksplatacyjnego i napraw komórki w 4% PFA, umyj i utrzymuj komórki w 1x PBS + 0,05% Azide Sodu.
Analiza neurosfer
1. Uzyskuj obrazy całych neurosfer przy użyciu ustawień kontrastu fazowego przy 10-krotnym powiększeniu. Upewnij się, że sfery się nie stykają. Zmierz średnią migrację za pomocą oprogramowania ImageJ.
2. Obrysuj zewnętrzny kontur neurosfery za pomocą narzędzia do rysowania linią odręczną. Dostęp do linii odręcznej można uzyskać, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę linii prostej. Ręczne śledzenie za pomocą myszy.
3. Użyj funkcji miary, aby obliczyć powierzchnię śladu. Upewnij się, że "obszar" jest wybrany jako odczyt w oknie "Ustaw pomiary" znajdującym się w zakładce Analiza. Na rysunku 2 zaznaczono ślad konturu zewnętrznego w kolorze niebieskim.
4. Śledź wewnętrzną masę komórkową kuli i zmierz powierzchnię. Na rysunku 2 zaznaczono ślad konturu wewnętrznego w kolorze czerwonym. Określ ilościowo średnią migrację, odejmując wewnętrzną masę komórki od całkowitego obszaru neurosfery.
5. Zmierz neurosfery, które wykazują gęsto upakowaną wewnętrzną masę komórkową z komórkami migrującymi jako ciągły dywan (ryc. 2).
6. Nie uwzględniaj komórek znajdujących się na zewnątrz dywanu lub odłączonych od neurosfery do pomiaru. Na rysunku 2 przedstawiono przykłady komórek (zakreślonych na biało), które są wyłączone z pomiaru dywanu zewnętrznego. Przeanalizuj co najmniej 20 neurosfer dla każdego stanu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Wybór neurosfer do testu migracji. (A) Obraz z kontrastem fazowym reprezentatywnego pola neurosfer po 24 godzinach. Wszystkie kulki mają mniej niż 100 μm i dlatego nie są zbierane do testu migracji. (B) Obraz z kontrastem fazowym reprezentatywnego pola neurosfer po 72 godzinach. Wszystkie kulki mieszczą się w zakresie od 100 μm ± 20 μm, co wskazuje, że są gotowe do pobrania do testu migracji...