Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Streszczenie

Źródło: Schildge, S. et al. Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy. J. Vis. Exp. (2013)

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja i posiewanie mieszanych komórek korowych

Mieszana izolacja komórek korowych dla kultur astrocytów może być przeprowadzona przy użyciu mysich szczeniąt P1 do P4. W celu uzyskania odpowiedniej gęstości astrocytów konieczne jest użycie 4 kory mózgowej młodych myszy na kolbę do hodowli tkankowej T75. Dlatego objętości w poniższym protokole są obliczane dla preparatu komórkowego przy użyciu 4 mysich szczeniąt.

1. Przed rozpoczęciem procedury preparacji należy ogrzać 30 ml pożywki do hodowli astrocytów (DMEM, wysoka zawartość glukozy + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej + 1% penicyliny/streptomycyny; patrz tabela) do temperatury 37 °C. Pokryć jedną kolbę T75 20 ml poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 50 μg/ml w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .
2. Do procedury preparacji przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki i materiały. Potrzebne będą nożyczki chirurgiczne, gładkie kleszcze drobnoziarniste, kleszcze z płaską końcówką, ręczniki papierowe, worek na odpady, 70% etanolu i 2 naczynia do preparowania (średnica 3,5 cm) na lodzie wypełnione 2 ml HBSS każda.
3. Delikatnie przytrzymaj i spryskaj głowę i szyję szczeniaka myszy 70% etanolem. Zwierzę składa się w ofierze poprzez ścięcie głowy za pomocą nożyczek.
4. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, od tyłu do przodu, wzdłuż skóry głowy, aby odsłonić czaszkę.
5. Ostrożnie przeciąć czaszkę od szyi do nosa. Wykonuje się dwa dodatkowe cięcia, aby umożliwić dalszy dostęp do mózgu: pierwsze cięcie wykonuje się przed opuszkami węchowymi, drugie poniżej móżdżku, aby odłączyć czaszkę od podstawy czaszki.
6. Za pomocą kleszczy z płaską końcówką płaty czaszki są delikatnie odchylane na bok, a mózg jest wyjmowany i umieszczany w pierwszym naczyniu preparacyjnym wypełnionym HBSS. Umieść naczynie z powrotem na lodzie i kontynuuj zbieranie wszystkich 4 mózgów.
7. Pozostała część procedury preparacji jest wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym. Najpierw opuszki węchowe i móżdżek są usuwane za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych (ryc. 1B).
8. Aby odzyskać korę, chwyć tylny koniec mózgu cienkimi kleszczami, wykonaj nacięcie w linii środkowej między półkulami, włóż drugi zestaw kleszczy do utworzonego zagajnika i oderwij płytkowatą strukturę kory od mózgu.
9. Ostrożnie wypreparuj opony mózgowe z półkul kory, ciągnąc cienkimi kleszczami (ryc. 1D'). Ten etap pozwala uniknąć zanieczyszczenia końcowej hodowli astrocytów komórkami opon mózgowych i fibroblastami. Przenieś przygotowane półkule kory mózgowej do drugiego naczynia wypełnionego HBSS i umieść je z powrotem na lodzie. Kontynuuj odpowiednio ze wszystkimi 4 korami.
10. Na koniec pokrój każdą półkulę kory na małe kawałki za pomocą ostrych ostrzy (około 4 do 8 razy).
11. W sterylnych warunkach przenieś kawałki kory mózgowej do jednej probówki Falcon o pojemności 50 ml i dodaj HBSS do całkowitej objętości 22,5 ml.
12. Dodać 2,5 ml 2,5 % trypsyny, wymieszać i inkubować tkankę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Mieszać przez sporadyczne wstrząsy co 10 minut.
13. Wirować przez 5 minut przy 300 x g, aby otopić kawałki tkanki kory mózgowej.
14. Ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację. Aby uniknąć utraty osadu tkankowego, można go mechanicznie zatrzymać za pomocą pipety. Dysocjację tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki poprzez dodanie 10 ml pożywki do posiewu astrocytów i energiczne pipetowanie za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki (20 do 30 razy). Dostosuj objętość do 20 ml za pomocą pożywki do posiewu astrocytów. Możesz udowodnić dysocjację tkanki kory na pojedyncze komórki, licząc za pomocą hematocytometru. Jedno przygotowanie 4 kory mózgowej myszy powinno dać 10–15 x10⁶ zdysocjowanych pojedynczych komórek.
15. Odessać PDL z kolby hodowlanej T75, rozlać na płytkę zdysocjowaną zawiesinę jednokomórkową i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ .

2. Uzyskanie wzbogaconej kultury astrocytów

1. Zmienić pożywkę 2 dni po posiewie zmieszanych komórek korowych i wszystkie 3 dni później.
2. Po 7 do 8 dniach, gdy astrocyty zlewają się ze sobą, a nakładający się mikroglej jest odsłonięty na warstwie astrocytów lub jest już odłączony od warstwy astrocytów (ryc. 2), potrząsaj kolbą T75 z prędkością 180 obr./min przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby usunąć mikroglej. Odrzuć supernatant zawierający mikroglej lub, jeśli chcesz przeprowadzić hodowlę i zbadać mikroglej, odkręć go i podaj na płytce do posiewu.
3. Dodać 20 ml świeżej pożywki do hodowli astrocytów i kontynuować, wytrząsając kolbę z prędkością 240 obr./min przez 6 godzin w celu usunięcia komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Ponieważ niektóre OPC nie odłączają się całkowicie od warstwy astrocytów, kontynuuj energiczne potrząsanie ręką przez 1 minutę, aby zapobiec zanieczyszczeniu OPC. Wyrzuć supernatant lub odwiruj go i połóż na płytce, jeśli chcesz hodować OPC.
4. Przepłukać pozostałą warstwę zlewających się astrocytów dwukrotnie PBS, odessać PBS, dodać 5 ml trypsyny-EDTA i inkubować w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C. Sprawdzaj oderwanie astrocytów co 5 minut i wymuś oderwanie astrocytów, uderzając kolbą o dłoń (2-3 razy).
5. Po odłączeniu astrocytów od kolby hodowlanej dodać 5 ml pożywki do hodowli astrocytów, wirować komórki w temperaturze 180 x g przez 5 minut, aspirować supernatant i dodać 40 ml świeżej pożywki do posiewu astrocytów. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1x10⁶ komórek po pierwszym podziale komórek. Umieścić komórki w dwóch kolbach hodowlanych T75 i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ . Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni.
6. 12–14 dni po pierwszym rozszczepieniu astrocyty są siane w odpowiednim stężeniu komórek na 24–48 godzin przed wykonaniem eksperymentu. Jedna kolba do hodowli tkankowej T75 powinna dać około 1,5–2 x10⁶ komórek po podziale drugiej komórki.

Wyniki

Rysunek 1. Rozwarstwienie kory pourodzeniowej myszy (P3). A) Cały mózg. B) Mózg po usunięciu opuszki węchowej i móżdżku. C) Izolacja kory mózgowej poprzez oderwanie płytkiej struktury kory mózgowej. D, D') Kora z miejsca brzusznego i grzbietowego z oponami mózgowymi (czarne strzałki wskazują tętnice oponowe). E) Kora bez opon mózgowych. Podziałka, 1,5 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki do hodowli astrocytów
DMEM wysoki poziom glukozy	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 31966-021
FBS inaktywowany termicznie	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10082-147	Stężenie końcowe: 10%
Penicylina-Streptomycyna	Technologie życiowe	Rozdział 15140-122	Stężenie końcowe: 1%
Roztwór do trawienia tkanki mózgowej
HBSS (Sieć HBSS)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14170-088
2,5% trypsyna	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15090-046	Stężenie końcowe: 0,25%
inny
70% (obj./obj.) etanolu	Roth	9065.2
Poli-D-lizyna	Milipor A-003	A-003-E
Woda	PAA (Agencja Ochrony	S15-012	Klasa hodowli komórkowej
Pbs	PAA (Agencja Ochrony	H15-002	Klasa hodowli komórkowej
0,05% trypsyna-EDTA	Technologie życiowe	25300-062
0,45 μm Filtr sterylny	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 16555
szalka Petriego 3,5 cm	BD Sokół	353001
Probówka Falcon 15 ml	BD Sokół	352096
Probówka Falcon o pojemności 50 ml	BD Sokół	Numer katalogowy: 352070
75 cm2 Kolba do hodowli tkankowych	BD Sokół	353136
Kleszcze drobne	Dumont	2-1032; 2-1033	#3c; #5
Kleszcze z płaską końcówką	KLS Martin	12-120-11
Nożyczki chirurgiczne 13 cm	Aesculap	BC-140-R
Mikroskop stereoskopowy	Księga Leica		MZ7.5
Mikroskop stereoskopowy + kamera	Księga Leica		MZ16F; DFC320
Mikroskop + kamera	Zeiss; Kanon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
wirówka	Eppendorf	5805000.017	Wirówka5804R
Wytrząsarka orbitalna	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Kąpiel wodna	Julabo powiedział:		SW20; 37 °C

T T Sar powiedział: powiedział: powiedział: