Hodowla komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura: procedura izolacji i hodowli komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura

Streszczenie

Źródło: Molino, Y. et al. Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): Skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptora. J. Vis. Exp.(2014)

Ten film przedstawia izolację mikronaczyń z mózgu szczura za pomocą kombinacji wirowania gradientu gęstości i enzymatycznego trawienia. Wyizolowane mikronaczynia można hodować w kolbie hodowlanej wstępnie pokrytej matrycą kolagenu i fibronektyny w celu uzyskania kolonii komórek śródbłonka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja mikronaczyń mózgu szczura

1. Do każdego preparatu i dla jednego eksperymentatora użyj 3 pięciotygodniowych szczurów Wistar.
2. W poniedziałek pierwszego tygodnia przygotować 2 kolby T75, pokrywając je kolagenem typu IV i fibronektyną, w stężeniu 1 μg/^cm2 w sterylnej wodzie hodowlanej (10 ml na T75). Pozostawić do przylegania w temperaturze 37 °C do momentu wysiewu mikronaczyń.
3. W środę rano pierwszego tygodnia poddać szczury eutanazji pod rosnącym strumieniem CO_{2 w} celu wywołania senności, utraty postawy i przerwy w oddychaniu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj głowice 70% etanolem. Odetnij głowy nożyczkami i przenieś je na suchą szalkę Petriego pod okapem z przepływem laminarnym.
4. Usunąć mózgi z czaszki bez móżdżku i nerwów wzrokowych, a następnie przenieść je na szalkę Petriego schłodzoną na lodzie i wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym (HBSS uzupełniony 1% BSA, penicylina 100 jednostek/ml i streptomycyna 100 μg/ml).
5. Przetnij mózgi na pół, aby oddzielić 2 półkule mózgowe i oddzielić śródmózgowie od przodomózgowia. Przenieś przodomózgowie na czystą szalkę Petriego na lodzie z buforem preparacyjnym.
6. Weź kilka półkul na nowej szalce Petriego z zimnym buforem preparacyjnym, aby ostrożnie usunąć opony mózgowe z przodomózgowia pod mikroskopem stereoskopowym z zakrzywionymi kleszczami nr 5. Następnie oczyść wnętrze mózgu, aby usunąć kołdrę z mieliny i uzyskać powłokę kory. Te kroki nie powinny zająć więcej niż 2 godziny w celu zachowania tkanek i przeżycia komórek.
7. Oddziel korę mózgową od 3 mózgów do 6 ml zimnego buforu rozwarstwiającego w homogenizatorze o pojemności 7 ml przez 10 ruchów w górę iw dół każdym z 2 tłuczków o różnych odstępach, 71 μm, a następnie 20 μm.
8. Podzielić zawiesinę, aby uzyskać ekwiwalent 1 kory w 1 ml 50 ml probówki Falcona i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
9. Trawić zawiesinę z 1 kory z 1 ml roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz / dypazy (60 μg / ml – 0,3 U / ml), DNazy typu I (35 μg / ml - 20 K jednostek/ml) i gentamycyny (50 μg / ml) w wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
10. Zmieszać 1 ml wytrawienia z 1 kory z 10 ml 25 % BSA/HBSS 1X i rozdzielić przez odwirowanie w zależności od gęstości przy 3 600 x g przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Ostrożnie przenieść górny krążek (mielinę i miąższ mózgu) oraz supernatant do czystej probówki Falcona o pojemności 50 ml i powtórzyć wirowanie. Powstałą osadkę zawierającą mikronaczynia mózgowe przechowywać w temperaturze 4 °C.
11. Ostrożnie wyrzuć górny dysk i supernatant. Zawiesić oba powstałe granulki zawierające mikronaczynia mózgowe za pomocą 1 ml zimnego HBSS 1X i przenieść do czystej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
12. Przemyć mikronaczynia przez dodanie 20 ml zimnego HBSS 1X i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
13. Następnie trawić mikronaczynia z 1 kory za pomocą 1 ml tego samego roztworu enzymatycznego, jak opisano w kroku 1.9, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w shakerze.
14. Następnie wymieszaj strawione mikronaczynia z każdej z 3 kory mózgowej w jednej probówce, a następnie rozdziel na dwie probówki Falcona o pojemności 50 ml, aby uzyskać mikronaczynia wyekstrahowane z równowartości półtorej (1,5) kory na probówkę. Dodać 30 ml zimnego buforu do rozwarstwiania i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
15. Zawiesić osad mikronaczynia w 10 ml DMEM/F12 uzupełnionego 20% surowicą pochodzącą z osocza ubogiego w płytki bydła, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 2 ng/ml), heparyną (100 μg/ml), gentamycyną (50 μg/ml) i HEPES (2,5 mM), nazwaną pożywką z komórek śródbłonka (ECM) uzupełnioną puromycyną w stężeniu 4 μg/ml.
16. Pobrać 2 powlekane kolby T75 z inkubatora, odessać nadmiar powłoki i umieścić mikronaczynia z każdej probówki w jednej kolbie T75 (mikronaczynia wyekstrahowane z 1,5 kory na kolbę T75).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica bydlęca płodu	Invitrogen	Numer katalogowy: 10270-098	-20 °C / 1 rok
BSA frakcja V niska endotoksyna	PAA (Agencja Ochrony	Zobacz materiał K45-011-500g	4 °C
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	Rozdział 15140-122	-20 °C
Kolby T75	Sokół Becton Dickinson	353135
Bufor HEPES (1 M)	Invitrogen	Numer katalogowy: 15630-056	4 °C / 1 rok
Kolagen typu IV mysz (10 x 1 mg)	Becton Dickinson	356233	-20 °C / 1 miesiąc
Osocze fibronektyny (5 mg)	Becton Dickinson	356008	-20 °C / 1 miesiąc
Nożyczki sprężynowe Vannas, proste (9 cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91500-09
Nożyczki proste (9 cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14568-09
Kleszcze Dumont #5/45 (11 cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11251-35
Graefe Szczypce, szerokość końcówki 0,8 mm	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11050-10
Graefe Szczypce, szerokość końcówki krzywej 0,8 mm	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11051-10
Kolagenazy / mieszanina dispazy (2 x 5 mg)	Diagnostyka Roche	Numer katalogowy 05 401 054 001	-20 °C / 3 miesiące
DNaza I (100 mg / 569 KU / mg)	Sigma Aldrich	DN25-100 mg	-20 °C / 1 rok
Gentamycyna (10 mg/ml)	Invitrogen	Numer katalogowy: 15710-049	4 °C / 1 rok
DMEM/F12	Invitrogen	Nr kat. 31331-028	4 °C
Surowica bydlęca z osocza ubogiego w płytki krwi (500 ml)	Nauki kliniczne	BT-214-100	-20 °C / 1 rok
bFGF (10 μg)	Invitrogen	Numer katalogowy: 13256-029	-20 °C / 6 miesięcy
Heparyna Na sól z błony śluzowej świni stopnia I	Sigma Aldrich	Zobacz materiał H3149-100KU	4 °C / 1 rok
Puromycyna	Sigma Aldrich	P8833-10 mg tabletki powlekane	-20 °C / 6 miesięcy

T powiedział: powiedział: