Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
4.2K wyświetleń
⸱
30 kwietnia 2023
Źródło: Le Joncour, V. et al. Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg guza w naczyniu. J. Vis. Exp. (2019)
W tym filmie opisujemy kompleksowy protokół do stworzenia modelu in vitro naśladującego barierę krew-mózg. Model ten jest obiecujący, jeśli chodzi o zrozumienie sposobu dostarczania środków terapeutycznych w leczeniu guzów mózgu.
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Założenie BBTB Mimics
UWAGA: Pożywka do hodowli komórkowych i suplementy są szczegółowo opisane w Tabeli Materiałów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rycina 1: Opis modelu bariery nowotworowo-mózgowej (BBTB).(A) Schematyczne przedstawienie lokalizacji różnych typów komórek. (B) Ilustracja umieszczenia wkładki na pokrywie płytki 6-dołkowej oraz techniki wysiewu astrocytów po stronie mózgu błony płytki. (C) Ilustracja przedstawiająca umieszczenie 6-dołkowej płytki umożliwiającej adhezję astrocytów. (D) Mikrofotografie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórek | |||
| bEND3 | Kontroler ATCC (Kontroler T | CRL-2299 | Hodowane w: DMEM (1g/L glukozy) uzupełnionym 10% FBS-5 mL L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny |
| HIFko unieśmiertelnione astrocyty myszy | Izolowany w laboratorium dr Gabriele Bergers | https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6 | Hodowane w: BME-1 uzupełnione 5% FBS-5 ml 1 M HEPES-5 mL 100 mM pirogronianu sodu - 3 g D-glukozy i 5 ml penicyliny / streptomycyny |
| HuAR2T | Odizolowany w laboratorium dr Dagmar Wirth | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Hodowane w: EBM-2 z SupplementMix normalne ludzkie astrocyty pierwotne Lonza CC-2565 Hodowane w: ABM z SingleQuots |
| Materiał i odczynniki | |||
| 100 mm x17 mm Talerz Nunclon Delta | ThermoFisher Naukowy | Numer katalogowy: 150350 | |
| 10 ml pipety serologicznej | ThermoFisher Naukowy | 170361 | |
| 15 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe | ThermoFisher Naukowy | Numer telefonu 339650 | |
| ABM Podłoże podstawowe 500 ml | Lonza | Zobacz materiał CC-3187 | Dla pierwotnych astrocytów ludzkich. ABM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. ABM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem rhEGF i FBS |
| Rozwiązanie do odłączania komórek Accutase | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Suplementy i czynniki wzrostu | Lonza | CC-4123 | |
| Suplement witaminy B27 | Gibco (firma Gibco) | Numer katalogowy: 17504-044 | Dla zarówno GBM +, jak i - średni |
| Podstawowy średni orzeł | ThermoFisher Naukowy | 21010046 | Zobacz materiał BME-1 |
| Corning Costar Płytki 6-dołkowe z powłoką TC | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrową Corning Transwell | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glukoza | Sigma-Aldrich | Kontroler G8270 | Rozpuścić w 50 ml BME-1 i sterylnym filtrze przed dodaniem do pożywki |
| Zmodyfikowana szynka Eagle's Medium/Nutrient F-12 firmy Dulbecco | Gibco (firma Gibco) | 21331-020 | Specyficzne dla kultury sfer pochodzących od pacjenta wyizolowanych w naszym laboratorium; Może się różnić w przypadku innych linii komórkowych glejaka |
| EBM-2 wzrost Podłoże SupplementMix | Komórka promocyjna | C-39216 | EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS |
| Śródbłonek podłoża podstawnego 2 (EBM-2) | Komórka promocyjna | C-22211 | EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej | ThermoFisher Naukowy | 10500056 | |
| Sól sodowa fluoresceiny | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | Czarne studzienki styropianowe z płaskim dnem (z dnem mikroprzezroczystym) |
| Menzel-Glä¤ser 0,9 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkowe | Thermo Scientific | 10313573 | |
| Tabletki PBS | Medicago | Numer katalogowy: 09-9400-100 | Jedna tabletka na litr dH2O, następnie wysterylizować roztwór przez autoklawowanie |
| Bromowodorek poli-D-lizyny | Sigma-Aldrich | Zobacz materiał P6407 | |
| Rekombinowany ludzki EGF | Peprotech | Zobacz materiał GMP100-15 | Dla GBM+ medium |
| Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.) | Peprotech | 100-18 mld | Dla GBM+ medium |
