Bariera nowotworowa krew-mózg lub model BBTB: adaptacja bariery krew-mózg lub model BBB w celu oceny dostarczania leków do guza

Streszczenie

Źródło: Le Joncour, V. et al. Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg guza w naczyniu. J. Vis. Exp. (2019)

W tym filmie opisujemy kompleksowy protokół do stworzenia modelu in vitro naśladującego barierę krew-mózg. Model ten jest obiecujący, jeśli chodzi o zrozumienie sposobu dostarczania środków terapeutycznych w leczeniu guzów mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Założenie BBTB Mimics

UWAGA: Pożywka do hodowli komórkowych i suplementy są szczegółowo opisane w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie astrocytów
   nuta: Następujące objętości są odpowiednie dla 10 cm płytki Petriego lub kolby do hodowli komórkowych T75.
   1. Pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych ostrożnie umyj wyhodowane astrocyty 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie wyrzucić PBS za pomocą pompy próżniowej i dodawać 2 ml odczynnika do dysocjacji komórek przez 5 minut (w temperaturze 37 °C, patrz Tabela Materiałów) w celu odłączenia komórek. Sprawdź odłączenie komórek pod mikroskopem. Nie należy przekraczać 5 minut inkubacji, aby ograniczyć stres na komórkach.
   2. Dodać 10 ml sterylnej pożywki do kompletnej hodowli komórek astrocytów (ABM+) do naczynia, aby zahamować aktywność odczynnika do dysocjacji komórek. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść oderwane komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy 250 rcf (przyspieszenie: 9 rcf/s, opóźnienie: 5 rcf/s) w temperaturze pokojowej (RT).
   3. W międzyczasie przygotuj wkładki (patrz Tabela materiałów): Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wkładki mózgiem do góry (Rysunek 1A) na pokrywie sterylnej płytki 6-dołkowej (Rysunek 1B). Sprawdź wcześniej, czy płytkę można umieścić do góry nogami na wkładkach bez dotykania lub przesuwania wkładek podczas procesu.
      UWAGA: Prawidłowe umieszczenie wkładek pozwala na uwięzienie zawiesiny astrocytów pomiędzy błoną a dnem studzienki.
   4. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzuć supernatant z zawiesiny komórek; ponownie zawieś osad astrocytów w 1 ml ABM+, delikatnie zawieszając osad na ściance probówki do 5 razy. Unikaj nadmiernego pipetowania komórek, aby ograniczyć stres na komórkach. Policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 1,5 x 10⁵ komórek w 400 μl ABM+/wkładka.
   5. Umieść zawiesinę komórkową na środku błony wkładki po stronie mózgu (ryc. 1B) i bardzo ostrożnie rozprowadź ją za pomocą siły kapilarnej za pomocą sterylnej końcówki pipety. Unikaj bezpośredniego kontaktu, ponieważ membrana jest szczególnie delikatna.
   6. Trzymając wkładki po stronie mózgu nadal skierowaną do góry, umieść 6-dołkową płytkę z powrotem na wkładkach. Gwarantuje to, że zawiesina komórek jest uwięziona między błoną a rzeczywistym dnem studzienki (ryc. 1C). Unikaj pęcherzyków powietrza w zawiesinie komórek, ponieważ zapobiegnie to jednorodnemu rozprzestrzenianiu się astrocytów na błonie.
   7. Umieścić płytkę i wkładki, stroną mózgową do góry, w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ),} aby umożliwić adhezję komórek przez co najmniej 2 godziny (astrocyty unieśmiertelnione mysim) i do 6 godzin (astrocyty pierwotne ludzkie).
      UWAGA: Ponieważ wkładki są utrzymywane do góry nogami, wizualizacja adhezji komórek pod mikroskopem nie jest możliwa. Dlatego zaleca się wysiewanie oddzielnego regularnego naczynia do hodowli komórkowej i kontrolowanie adhezji komórek w naczyniu w czasie. Ostrożna manipulacja membraną jest koniecznością, ponieważ wyniki będą niewiarygodne, gdy membrany zostaną uszkodzone.
   8. Pod koniec okresu inkubacji sprawdzić, czy nie ma wycieków z zawiesiny komórek poza obszarem wysiewu i wyrzucić wkładki, jeśli są nieszczelne. Przywróć 6-dołkową płytkę do jej normalnej pozycji, z wkładkami, które będą teraz miały krew do góry (Ryc. 1A). Dodaj 2,6 ml ABM+ do każdej studzienki. Wlać 2,5 ml kompletnej pożywki astrocytowej do każdej wkładki i umieścić płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ ).

2. Przygotowanie komórek śródbłonka

UWAGA: Dla mysich komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (bEND3), komórki muszą osiągnąć 100% konfluencji, aby zapewnić maksymalne kontakty komórka-komórka, wywołując optymalną ekspresję białka ścisłego połączenia w dniu eksperymentu. Nie dotyczy to ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HuAR2T), ponieważ obecność astrocytów jest wymagana do ekspresji białka ścisłego połączenia dla tych komórek.

1. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem dla astrocytów w celu dysocjacji komórek. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzucić supernatant; ponownie zawiesić osad komórek śródbłonka w 1 ml kompletnej pożywki do hodowli komórek śródbłonka (EBM+), powoli pipetując zawiesinę komórek na ściance probówki do 5 razy. Należy unikać nadmiernego pipetowania komórek, aby ograniczyć obciążenie komórek. Policz komórki i dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 2 x 10⁵ komórek w 2,5 ml / wkładkę pożywki do hodowli komórek śródbłonka pozbawionej surowicy (EBM-) i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-A (VEGF-A).
2. Wyjąć płytkę zawierającą wkładki, ostrożnie wyrzucić pożywkę od strony krwi i zastąpić ją 2,5 ml zawiesiny komórek śródbłonka. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ ) i pozostawić na noc, aby komórki śródbłonka przylgnęły do błony.
3. Następnego dnia przygotuj sterylną 6-dołkową płytkę, przenosząc 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki astrocytowej bez surowicy (ABM-) do każdej studzienki. Dotykając wkładek sterylnymi kleszkami, należy ostrożnie wyrzucić kompletne podłoże śródbłonka od strony krwi, umieścić wkładkę w nowej płytce zawierającej ABM- i dodać 2,5 ml EBM-.
   nuta: Zastosowanie EBM- ma kluczowe znaczenie dla ustanowienia bariery śródbłonkowej.
4. Pozostawić wkładki w inkubatorze (w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 )} przy minimalnych zakłóceniach fizycznych i wahaniach temperatury przez 5 dni, co pozwala na wytworzenie błony podstawnej śródbłonka, kontakty astrocytów z komórkami śródbłonka i ostatecznie tworzenie naśladujące BBTB. Wymień pożywkę w dniu transferu na hodowle komórek glejaka.

3. Przygotowanie komórek glejaka

UWAGA: Chociaż używane są tutaj kule glejaka pochodzące od pacjentów, następujący protokół może być łatwo dostosowany do przylegających, dostępnych na rynku komórek glejaka, takich jak U-87MG.

1. Opcjonalnie, w celu obrazowania immunofluorescencyjnego, należy umieścić do czterech okrągłych sterylnych szkiełek nakrywkowych borokrzemianowych (ø 0,9 cm) na studzienkę w 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml poli-D-lizyny (0,01%). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. W międzyczasie ostrożnie przenieś kulki nowotworowe z naczynia do hodowli komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej. Wirować kulki guza przez 3 minuty przy 250 rcf.
3. Odrzucić supernatant, delikatnie zawiesić kulki w 1 ml pożywki komórkowej glejaka wolnego od bFGF/EGF (GBM-) i policzyć komórki. Dostosuj gęstość komórek do około 10⁴ kulek/ml (10⁵ komórek/ml) w GBM-.
4. Wyrzuć poli-D-lizynę z dołków i przepłucz je 3x sterylnym PBS. Wysiewaj płytkę 3 ml / studzienkę zawiesiny sferoidalnej guza i przenieś wkładki z naśladowcą BBB na zawiesinę komórek nowotworowych.
5. Inkubować przez noc (w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ ), aby umożliwić równowagę między krwią a stroną guza mózgu. Następnego dnia zastąp pożywkę po stronie krwi EBM uzupełnioną interesującymi cząsteczkami/lekami/nanocząsteczkami. Próbki pobiera się w miarę upływu czasu w celu bezpośredniego oznaczania ilościowego, jak opisano w poprzednim rozdziale. Komórki są utrwalane w precyzyjnym punkcie czasowym w celu obrazowania fluorescencyjnego.

Wyniki

Rycina 1: Opis modelu bariery nowotworowo-mózgowej (BBTB).(A) Schematyczne przedstawienie lokalizacji różnych typów komórek. (B) Ilustracja umieszczenia wkładki na pokrywie płytki 6-dołkowej oraz techniki wysiewu astrocytów po stronie mózgu błony płytki. (C) Ilustracja przedstawiająca umieszczenie 6-dołkowej płytki umożliwiającej adhezję astrocytów. (D) Mikrofotografie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórek
bEND3	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2299	Hodowane w: DMEM (1g/L glukozy) uzupełnionym 10% FBS-5 mL L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny
HIFko unieśmiertelnione astrocyty myszy	Izolowany w laboratorium dr Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Hodowane w: BME-1 uzupełnione 5% FBS-5 ml 1 M HEPES-5 mL 100 mM pirogronianu sodu - 3 g D-glukozy i 5 ml penicyliny / streptomycyny
HuAR2T	Odizolowany w laboratorium dr Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Hodowane w: EBM-2 z SupplementMix normalne ludzkie astrocyty pierwotne Lonza CC-2565 Hodowane w: ABM z SingleQuots
Materiał i odczynniki
100 mm x17 mm Talerz Nunclon Delta	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 150350
10 ml pipety serologicznej	ThermoFisher Naukowy	170361
15 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe	ThermoFisher Naukowy	Numer telefonu 339650
ABM Podłoże podstawowe 500 ml	Lonza	Zobacz materiał CC-3187	Dla pierwotnych astrocytów ludzkich. ABM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. ABM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem rhEGF i FBS
Rozwiązanie do odłączania komórek Accutase	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Suplementy i czynniki wzrostu	Lonza	CC-4123
Suplement witaminy B27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044	Dla zarówno GBM +, jak i - średni
Podstawowy średni orzeł	ThermoFisher Naukowy	21010046	Zobacz materiał BME-1
Corning Costar Płytki 6-dołkowe z powłoką TC	Sigma-Aldrich	CLS3506
Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrową Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270	Rozpuścić w 50 ml BME-1 i sterylnym filtrze przed dodaniem do pożywki
Zmodyfikowana szynka Eagle's Medium/Nutrient F-12 firmy Dulbecco	Gibco (firma Gibco)	21331-020	Specyficzne dla kultury sfer pochodzących od pacjenta wyizolowanych w naszym laboratorium; Może się różnić w przypadku innych linii komórkowych glejaka
EBM-2 wzrost Podłoże SupplementMix	Komórka promocyjna	C-39216	EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS
Śródbłonek podłoża podstawnego 2 (EBM-2)	Komórka promocyjna	C-22211	EBM+: zawiera wszystkie dodatki z mieszanki suplementów. EBM -: wszystkie dodatki z wyjątkiem VEGF-A i FBS
Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej	ThermoFisher Naukowy	10500056
Sól sodowa fluoresceiny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F6377
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Czarne studzienki styropianowe z płaskim dnem (z dnem mikroprzezroczystym)
Menzel-Glä¤ser 0,9 cm okrągłe borokrzemianowe szkiełka nakrywkowe	Thermo Scientific	10313573
Tabletki PBS	Medicago	Numer katalogowy: 09-9400-100	Jedna tabletka na litr dH2O, następnie wysterylizować roztwór przez autoklawowanie
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6407
Rekombinowany ludzki EGF	Peprotech	Zobacz materiał GMP100-15	Dla GBM+ medium
Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.)	Peprotech	100-18 mld	Dla GBM+ medium

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: