Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Homogenizacja
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C.
- Dodać 1,5 ml trikainy (15 mM) do 90-milimetrowych szalek Petriego zawierających 50 larw w 50 ml pożywki zarodkowej E3 poddanej działaniu 200 μM PTU, aby je ostatecznie znieczulić.
- Odessać 10 znieczulonych larw z szalek Petriego za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml.
- Przenieś znieczulone larwy 10 na 10 na 55-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowatą pożywką zarodkową E3 + trikainą.
- Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw 10 larw w środku szalki Petriego. Następnie przeciąć głowy larw powyżej woreczka żółtkowego za pomocą mikronożyczek chirurgicznych (z wyłączeniem pęcherza pławnego, aby uniknąć pływających głów).
- Zassać głowice z szalek Petriego za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Poczekaj, aż wszystkie główki zbiorą się w końcówce pipety, a następnie przenieś je do szklanego homogenizatora zawierającego 1 ml lodowatego podłoża A (przenieść w minimalnej objętości, aby zmniejszyć rozcieńczenie pożywki A przez E3 + trikaina). Trzymaj szklany homogenizator na lodzie. Użyć jednego homogenizatora na warunki doświadczalne.
- Każdą małą szalkę Petriego zawierającą lodowatą pożywkę E3 + Trikaine należy wymieniać na nową co 30 minut, aby upewnić się, że transsekcja odbywa się w zimnym podłożu E3 + Trikaine.
- Wymień lodowaty nośnik A w szklanym homogenizatorze, gdy kolor zacznie blaknąć.
UWAGA: Podłoże Rozcieńczenie może zmienić tkankę głowy z powodu zmian temperatury.
- Po zebraniu wszystkich głowic (600 głowic/stan) usuń maksymalną objętość pożywki A ze szklanego homogenizatora i zastąp ją 1 ml świeżego, lodowatego podłoża A.
- Rozbij tkankę mózgową za pomocą szczelnego szklanego homogenizatora na lodzie. Wykonaj 40 rund miażdżenia i obrotów dla larw 3–5 dpf i 50 dla larw 7 i 8 dpf.
- Dodaj 2 ml pożywki A do zawiesiny komórek (1 ml pożywki A/200 głów), co rozcieńczy komórki i zmniejszy ich aglomerację mieliną, aby ułatwić ich separację podczas wirowania w pożywce o gradiencie gęstości.
- Aby wyeliminować aglomerację komórek, przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm umieszczone na zimnej probówce sokoła o pojemności 50 ml utrzymywanej na lodzie. Powtórz tę operację 3 razy.
- Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i wirować je w temperaturze 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant za pomocą strzykawki 10 ml + igły 23G x 1''.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml lodowatego podłoża o gradiencie gęstości 22%, delikatnie pokrytego 0,5 ml lodowatego DPBS 1x (nie mieszaj ich, będzie widoczna interfaza między obydwoma roztworami).
- Rurki wirujące o masie 950 g bez hamulca i z wolnym przyspieszaniem przez 30 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Ten krok oddziela mielinę od innych komórek poprzez sekwestrację jej na interfazie DPBS 1x i ośrodka o gradiencie gęstości 22%, podczas gdy komórki będą osadzać się na dnie probówki. Usuwanie mieliny jest bardziej skuteczne, gdy stężenie komórek nie jest zbyt wysokie.
- Za pomocą strzykawki 10 ml + igły 23G x 1 '' odrzuć maksimum DPBS, pożywki gradientu gęstości i mieliny uwięzionej na ich interfazie.
- Umyj komórki 0,5 ml pożywki A + 2% normalnej surowicy koziej (NGS), a następnie wiruj probówki o wadze 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić maksimum supernatantu, a następnie zebrać wszystkie osadki komórek z tych samych warunków doświadczalnych razem w 1 ml pożywki A + 2% NGS.
- Jeśli interesujące komórki wyrażają fluorescencyjne makrofagi/mikroglej podobny do białka z mpeg1:eGFP lub neurony z transgenicznych ryb NBT:DsRed, przeprowadź zawiesinę komórkową przez nasadkę sitka komórkowego 35 μm i przenieś je do zimnych probówek FACS o pojemności 5 ml na lodzie, chronionych przed światłem.
UWAGA: Alternatywnie można przeprowadzić barwienie immunologiczne mikrogleju.