Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Barwienie immunologiczne mikrogleju
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad komórkowy uzyskany z komórek hodowli mózgu za pomocą 0,3 ml pożywki A + 2% normalnej surowicy koziej lub NGS. Podziel je na 3 probówki po 1,5 ml: jedną dla niebarwionych komórek w celu pomiaru autofluorescencji z komórek będących przedmiotem zainteresowania, drugą dla przeciwciała drugorzędowego (1/200) w celu zmierzenia niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego z mikroglejem, a trzecią jako test (mysie przeciwciało monoklonalne 4C4 (specyficzne dla mikrogleju) (1/20) + przeciwciało drugorzędowe (1/200)).
- Dodaj Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) w stężeniu 1% do komórek (wszystkie probówki), aby zablokować interakcje CD16 / CD32 z domeną Fc immunoglobulin. Inkubować komórki przez 10 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
- Dodać przeciwciało 4C4 (1/20) do komórek (probówka 3) i inkubować przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut.
- Wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatant.
- Umyć raz 0,5 ml pożywki A + 2% NGS, a następnie wirować probówki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić osad komórkowy z 0,5 ml pożywki A + 2% NGS i inkubować komórki z LEAF w stężeniu 1% przez 10 minut, delikatnie mieszając co 5 minut.
- Dodać przeciwciało drugorzędowe (1/200) do komórek (probówka 2 i 3). Inkubować komórki przez 30 minut z delikatnym mieszaniem co 10 minut i lekką ochroną.
- Wirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
- Przemyć dwukrotnie 0,5 ml pożywki A + 2% NGS, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml pożywki A + 2% NGS.
- Przepuść zawiesinę komórek przez nasadkę sitka o wielkości 35 μm i przenieś je do zimnych 5 ml komórek aktywowanych fluorescencją lub probówek FACS na lodzie, chronionych przed światłem.
2. Sortowanie komórek (FACS)
UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C.
- Sortuj neurony, makrofagi/mikroglej i mikroglej za pomocą FACS.
UWAGA: Ten krok jest zwykle wykonywany przez członka personelu obiektu FACS, a ustawienia zależą od rodzaju używanego sprzętu.
- Dodaj DAPI w stężeniu 1 μg/ml do każdej probówki FACS, aby oznaczyć martwe komórki.
- Skonfiguruj FACS i sortuj neurony, makrofagi/mikroglej lub mikroglej ze wszystkich komórek mózgowych. Oddziel komórki od zanieczyszczeń w zależności od ich wielkości i ziarnistości, a następnie bramkuj pojedyncze komórki przez rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne. Wyklucz martwe komórki przez etykietowanie DAPI z żywych komórek. Zidentyfikuj neurony, makrofagi/mikroglej lub mikroglej na podstawie ich odpowiedniego pozytywnego barwienia.
- Zbierz komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml lodowatego podłoża A + 2% NGS na lodzie. Używaj różnych probówek dla każdego typu ogniwa.
- Wirować probówki o gramaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatant.
- Przemyć raz 0,5 ml pożywki A, a następnie wyrzucić maksimum supernatantu.
