$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hodowla komórkowa i przygotowanie rusztowania
UWAGA: Rusztowania powinny być przygotowane 48 godzin przed implantacją u myszy. Poniższe woluminy są dostarczane dla każdego rusztowania. Pomnóż ilości w razie potrzeby dla dodatkowych rusztowań.
- Pociąć rusztowania z poli(kwasu mlekowego) (PLA) na kawałki wielkości jamy resekcyjnej (około 2 mm x 2 mm). Rusztowania można ciąć ręcznie za pomocą nożyczek lub dziurkacza w celu uzyskania powtarzalności.
- Sterylizować, zanurzając w 70% etanolu na 15 minut, a następnie zanurzając w PBS. Umieść rusztowanie w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny, przygotowując komórki do wysiewu.
- Podnieś wyhodowane MSCs za pomocą 0,05% trypsyny (3-5 ml dla kolby T75). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki się podniosły, a następnie dodaj 7-10 ml DMEM do kolby, aby dezaktywować trypsynę.
- Przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Granulki 5 x 105 MSC na każde rusztowanie przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 min.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić MSC w 5 μl DMEM na 5 x 105 komórek.
- Przygotuj rusztowania do siewu, osuszając je.
- Usuń rusztowanie z zanurzenia w DMEM za pomocą kleszczy i tymczasowo umieść je na pokrywie płytki 6-dołkowej. Podnieś rusztowanie z pokrywy, pozostawiając kroplę nadmiaru DMEM.
- Umieść rusztowanie z powrotem na pokrywie w nowym, suchym miejscu. Powtórz 3-5 razy, a następnie umieść częściowo wysuszone rusztowanie na nowej 6-dołkowej płytce do wysiewu. Powtórz te czynności dla każdego rusztowania.
nuta: Częściowo wysuszone rusztowanie zapewnia optymalne wyniki wysiewu komórek. Jeśli rusztowanie jest zbyt mokre, komórki zsuną się z rusztowania i przylgną do płyty studzienki poniżej. Jeśli rusztowanie jest zbyt suche, kropla nie rozprzestrzeni się po całym rusztowaniu, co spowoduje słabą początkową dystrybucję komórek.
- Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj fiolkę z komórkami macierzystymi, aby ujednolicić zawiesinę, ponieważ niektóre komórki mogły osiąść na dnie.
- Powoli odpipetować 2,5 μl świeżo wymieszanej zawiesiny MSC bezpośrednio na rusztowaniu, tworząc małą kropelkę na górze rusztowania.
- Dodaj 300 μl DMEM do krawędzi każdej studzienki. Zapobiegnie to szybkiemu parowaniu kropelki komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, pozwalając komórkom przyłączyć się do rusztowania.
- Za pomocą kleszczy delikatnie odwróć rusztowania w płycie studziennej. Wysiew: 2,5 μl świeżo zmieszanej zawiesiny MSC (daje to w sumie 5 x 105 komórek wysianych na rusztowanie). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, pozwalając komórkom przyłączyć się do rusztowania.
- Przykryj rusztowania w DMEM, dodając 2 ml do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Delikatnie podnieś rusztowania, aby media mogły pod nimi przepływać. Inkubować w tym stanie w temperaturze 37 °C przez 48 godzin przed zabiegiem implantacji.
- Sprawdź rusztowania po 24 godzinach i dodaj/zmień pożywkę, jeśli zaobserwuje się nadmierne parowanie lub odbarwienie podłoża z powodu braku równowagi pH.