$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ekstrakcja nerwu kulszowego
- Weźmy myszy, którym wcześniej wstrzyknięto komórki rakowe do nerwu kulszowego i poddaj je eutanazji za pomocą CO2 . Umieść mysz na jej brzusznej stronie i ustabilizuj dystalne kończyny za pomocą szpilek.
- Usunąć skórę z grzbietowej strony kończyny, w którą wykonano wstrzyknięcie, oraz tułowia.
- Za pomocą rozwarstwienia odsłoń nerw kulszowy głęboko w mięśnie.
- Nerw przepływa między kością biodrową a kością krzyżową. Aby mieć dostęp do nerwu w okolicy rdzenia kręgowego, oddziel dwie kości. Najpierw włóż zamknięte nożyczki w wąski obszar, w którym znajduje się nerw kulszowy, a następnie otwórz nożyczki, trzymając mysz. Bądź delikatny i utrzymuj integralność nerwu kulszowego podczas sekcji.
- Ostrożnie wypreparuj nerw kulszowy dystalnie do końca kości udowej i proksymalnie do rdzenia kręgowego.
nuta: Zaatakowane nerwy są niezwykle delikatne i podatne na pękanie pod wpływem napięcia lub siłowego obchodzenia się.
- Zbierz nerw, najpierw przecinając jego dystalny koniec. Ostrożnie unieś nerw, uwalniając go od sąsiedniej tkanki. Przetnij nerw na bliższym końcu, jak najbliżej jego wyjścia z kręgosłupa.
- Następnie zapisz całkowitą długość inwazji za pomocą suwmiarki z noniuszem. To makroskopowe oszacowanie ma jedynie charakter orientacyjny.
2. Przetwarzanie i kwantyfikacja nerwów
- Osadź wypreparowany nerw w związku OCT. Upewnij się, że nerwy są umieszczone wzdłuż i tak płasko na dnie formy, jak to możliwe.
- Wskaż na kasecie bliższą i dalszą stronę nerwu, zaznaczając literę P (proksymalny) i D (dystalny).
- Umieść osadzone nerwy na suchym lodzie, jeśli nie zostaną natychmiast pocięte. Próbka może być przechowywana w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.
- Pobrać próbki za pomocą mikrotomu Cryostat o grubości 5 μm i umieścić skrawki na szkiełkach podstawowych. Jeśli to możliwe, dopasuj dwie sekcje nerwowe na szkiełko. Wskaż bliższą stronę nerwu.
- Bejce szkiełkują za pomocą barwienia H&E.
- Skanuj cyfrowo barwione odcinki nerwów za pomocą skanera slajdów, który dostarcza dane cyfrowe o wysokiej rozdzielczości.
- Korzystając z oprogramowania do obrazowania, określ ilościowo długość inwazji, klikając przycisk pomiaru odległości, obszar inwazji lub inne żądane parametry. Aby dobrze oszacować długość inwazji, użyj wielu odcinków (od 2 do 4) tego samego nerwu.