Donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych (NSC) w modelu mysim: procedura ukierunkowanego na nowotwór dostarczania NSC załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu zawierającego guz mózgu

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Yu, D. et al. donosowe dostarczanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim. J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu z guzem mózgu. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg, ułatwiając ich dostarczenie do miejsca guza w mózgu w celu zastosowania terapeutycznego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne ludzkich NSC (Rysunek 1A)

NSC z kulturą płytkową w kolbach hodowlanych T75 aż do osiągnięcia 90% zbieżności.
Umieścić kolby do hodowli komórkowych w wilgotnej komorze / inkubatorze CO₂ z utrzymywanym poziomem 1%_O2 przez 24 godziny, za pośrednictwem dopływu gazu N₂ kontrolowanego przez automatyczny wbudowany przepływomierz. Komórki te są określane jako ^HNSC. Kontrolne NSC ^Nsą generowane jako:
1. Utrzymuj ludzkie NSC (klony HB1.F3.CD) w pożywce DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w 95% powietrza w pomieszczeniu i 5% CO_{2 .}

2. Obciążenie ludzkich NSC wirusem onkolitycznym (Rysunek 1B-1H)

Zakażone ^NNSC, ^HNSC 50 warunkowymi cząstkami wirusa adenowirusa replikacyjnego (CRAd)-S-pk7 na komórkę.
Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej z okresowym stukaniem, umyć komórki trzykrotnie pożywką w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusa i zawiesić komórki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej do wstrzykiwań.
ostrożność: Przeprowadzanie wszystkich procedur hodowli komórkowych in vitro związanych z wirusem w obiektach o odpowiednim oznaczeniu poziomu bezpieczeństwa biologicznego, takiego jak BSL2. Badacze zajmujący się wirusem onkolitycznym muszą nosić odpowiednie środki ochrony osobistej zgodnie z wytycznymi instytucji zajmujących się zwierzętami.

3. Donosowe podawanie terapeutycznych NSC (Rysunki 1D i Ryc. 2D)

Hodowla i zbieranie NSC (^NNSC, ^HNSC).
Znieczulenie myszy poprzez wstrzyknięcie dożylnie mieszaniny ketaminy i ksylazyny zgodnie z procedurą:
1. Znieczulić zwierzę na podstawie masy ciała przy użyciu zatwierdzonych odczynników, tj. poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (50–100 mg/kg; zatwierdzony zakres dawek należy sprawdzić w instytucjonalnym IACUC) i ksylazyny (5–10 mg/kg; zatwierdzony zakres dawek należy sprawdzić w instytucjonalnym IACUC) w 200–250 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej, lub za pomocą 4-5% znieczulenia izofluranem za pomocą urządzenia wziewnego.
Umieść myszy na czystej zasłonie przodem do góry, z poduszką grzewczą pod spodem, aby utrzymać temperaturę ciała. Wyreguluj wyściełaną poduszkę wykonaną ze zwiniętych ręczników papierowych za pomocą taśm, aby zapewnić pionowy kąt nozdrzy po umieszczeniu pod głową myszy.
Za pomocą mikropipety dozować 2 μl zawiesiny NSC do każdego nozdrza myszy. Potwierdź wizualnie aspirację kropli przed przejściem do następnej myszy. Całkowita liczba dostarczonych komórek może być określona przez użytkownika; zużyć 62 500–125 000 komórek/μl, tak aby 0,5–1 milion komórek mogło zostać dostarczonych w dawkach 4 x 2 μl.
Użyj timera, aby zapewnić 5-minutowe odstępy między każdym podaniem zawiesiny komórek, do 4 razy.
Umożliwić zwierzętom odzyskanie mobilności w komorze rekonwalescencyjnej, przy zachowaniu pozycji leżącej na plecach przez cały czas.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Schemat blokowy ogólnych procedur przygotowania komórek macierzystych przed podaniem donosowym. (A–C) Wstępne leczenie hipoksyjne lub modyfikacje genetyczne komórek macierzystych w celu nadekspresji CXCR4. (B–D) Etapy mycia, dysocjacji enzymatycznej, pobierania i liczenia komórek są wykonywane w celu późniejszego załadowania komórek macierzystych ładunkiem...