Generowanie mikroguzów: technika hodowli in vitro do hodowli mikroguzów 3D w celu analizy odpowiedzi na leczenie farmakologiczne

Streszczenie

Źródło: Gilbert, A. N. et al. Generowanie mikroguzów przy użyciu 3D ludzkiego systemu hodowli biożelu i komórek glejaka pochodzącego od pacjenta do profilowania kinomicznego i testowania odpowiedzi na leki. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie generujemy mikroguzy z komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów za pomocą ludzkiego biożelu 3D. Te mikroguzy bardzo przypominają mikrośrodowisko guza in vivo i służą jako potencjalne platformy do testowania leków.

Protokół

1. Generacja mikronowotworów

1. Przygotowanie odczynników
   1. Przygotuj kompletny NBM, dodając następujące substancje do jednej butelki o pojemności 500 ml pożywki neurobazalnej (NBM), aby przygotować kompletny NBM: 10 ml suplementu B-27 bez witaminy A, 5 ml suplementu N2, 100 μl EGF, 100 μl czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)-zasadowego, 5 ml amfoterycyny B, 0,5 ml gentamycyny, 5 ml L-glutaminy i przygotuj zneutralizowany biożel ludzki o wysokiej gęstości (HuBiogel) (HDHG w dawce 3 mg / ml) zgodnie z wewnętrznym protokołem. Można również stosować podobne matryce biożelowe.
2. Produkcja i hodowla mikronowotworów
   1. Otrzymać świeżo zdysocjowane komórki PDX w postaci zawiesiny pojedynczej komórki w pełnym NBM, na lodzie.
   2. Wymieszać zawiesinę komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego (0,4% w PBS) i przeanalizować za pomocą hemocytometru w celu określenia liczby komórek i żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego. Usuń objętość niezbędną do wygenerowania 50 000 komórek / mikroguz gdzie objętość = (50 000 komórek / guz * # guzy) / (liczba żywych komórek / 1 ml) i umieść w świeżej stożkowej probówce.
   3. Zagęścić komórki przez odwirowanie w temperaturze 150 x g przez 8 minut, w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym roztworze HDHG w końcowym stosunku 1 część komórek w FBS i 4 części HDHG.
   4. Za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej dozuj 10 μl mieszaniny komórek szpilkowych i HDHG na 96-pinową stalową płytkę (z powłoką hydrofobową) w celu wygenerowania mikroguzów (kulki o średnicy 2 mm, z których każdy zawiera 50 000 komórek).
   5. Umieść kulki nowotworowe 3D w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO₂, nawilżone) na 15 minut, aby zżelować kulki.
   6. Po żelowaniu przenieś mikroguzy (10 μl) do niestandardowej komory hodowlanej zawiesiny (50 ml) lub naczynia hodowlanego o dużej objętości (10 cm) zawierającego kompletny NBM za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej i niestandardowego urządzenia szpilkowego.
   7. Po 1-2 dniach w inkubatorze do hodowli tkankowych przenieś mikroguzy na 96-dołkowe płytki hodowlane zawierające 50 μl NBM/studzienkę za pomocą pipety dozującej z szeroką końcówką i wykonaj różne protokoły testowe i analityczne.
3. Leczenie farmakologiczne i utrzymanie mikronowotworów
   1. Wybierz końcowe stężenia do testów narkotykowych.
      UWAGA: Jeśli lek ma znaną skuteczność w hodowli 2D, wybierz 2x IC50 jako stężenie dawki środkowej i wybierz 3-krotne seryjne rozcieńczenia powyżej i poniżej, co daje w sumie 5 poziomów dawki. Na przykład, jeśli IC50 wynosi 9 μM dla leku w hodowli 2D, wybierz 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM i 162 μM jako końcowe stężenie do testowania leków.
   2. Przygotować 2x roztwór dozujący lek w kompletnym NBM z zapasu dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć roztwór dozujący w 1% pożywce DMSO, aby przygotować 5 dawek, 3-krotne seryjne rozcieńczenie.
   3. Dodać 50 μl roztworu dozującego do studzienki mikroguza, zawierającej 50 μl na płytkach testowych, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO 0,5%. Powtórzyć dla każdej kontrpróby (np. 4) dla każdej dawki leku określonej w kroku 1.3.1.
   4. Utrzymuj kultury w 37 °C, 5% CO₂, wilgotnym inkubatorze do kultur tkankowych przez 1–14 dni. Podawaj kultury bakterii dwa razy w tygodniu, odświeżając pożywkę i roztwór leku, jak powyżej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenza-I	Sigma-Aldrich	Emisja CO130
Neurobazalny-A	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10888-022
Suplement N-2	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17502-048	1x stężenie końcowe
B-27 Suplement bez witaminy A	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 12587-010	1x stężenie końcowe
Rekombinowany ludzki FGF-zasadowy	Technologie życiowe	PHG0266	Stężenie końcowe 10 ng/ml
L-glutamina	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	Stężenie końcowe 2 mM
Gentamycyna	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15750-060	Stężenie końcowe 50 ng/ml
Błękit trypanowy	Pierce ThermoScientific	Numer katalogowy: 15250-061
Hubiożel o wysokiej gęstości	Nauki biologiczne Vivo	HDHG-5
Dmso	rybak	Zobacz materiał BP231	Do rozpuszczania kalceiny AM i związków
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco z Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	Rozcieńczony do 1x ultraczystą wodą MiliQ (do prania przed utrwaleniem)
10% neutralna buforowana formalina	protokół	Numer katalogowy: 032-060
Szalki Petriego ze szkła 100 mm	rybak	08-748D