Izolacja nabłonka brodawek obwodowych (CVP) z modelu mysiego: procedura enzymatyczna mająca na celu oddzielenie nabłonka CVP od języka myszy

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Shechtman, L. A. et al. Generacja i hodowla organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smaku dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy izolację nabłonka brodawek okołokolacyjnych (CVP) od mysiego języka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja nabłonka CVP

Poddać myszy eutanazji za pomocą uduszenia CO₂ zgodnie z przepisami IACUC, a następnie zatwierdzoną metodą wtórną, taką jak obustronna torakotomia, zwichnięcie szyjki macicy, dekapitacja lub wykrwawienie.
Użyj dużych sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć policzki i złamać szczękę. Podnieś język i przetnij wędzidełko językowe, aby oddzielić język od dna jamy ustnej. Wytnij język i zbierz go w sterylnym, lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (dPBS) z Ca²⁺ i Mg²⁺.
Usuń i wyrzuć przedni język, przecinając żyletką tylko przednią część wyniosłości międzytrzonowej (ryc. 1A, linia przerywana). Użyj delikatnej chusteczki do włosów, aby usunąć wszelkie włosy i nadmiar płynu z tylnego języka.
Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 200–300 μl roztworu enzymu do wstrzykiwań (końcowe stężenie: 2 mg/ml kolagenazy typu I i 5 mg/ml Dispase II w stylu Ca²⁺/Mg²⁺-containing dPBS, rozcieńczony z 10 mg/ml roztworów podstawowych) i włóż igłę 30 G x 1/2 tuż nad wyniosłością międzytrzonową (Rysunek 1B, strzałka) aż do przodu CVP (Rysunek 1B, ramka). Wstrzyknąć roztwór enzymu pod i na bocznych krawędziach CVP między nabłonkiem a leżącymi pod nim tkankami (blaszka właściwa, mięsień). Podczas wykonywania wstrzyknięcia należy powoli i w sposób ciągły wyjmować strzykawkę z języka.
Inkubuj język w sterylnym stylu Ca²⁺/Mg²⁺-free dPBS w temperaturze pokojowej dokładnie przez 33 min.
Wykonuj małe nacięcia w nabłonku obustronnie i tuż przed CVP za pomocą bardzo drobnych nożyczek preparacyjnych i delikatnie obierz nabłonek, podnosząc go cienkimi kleszkami. Gdy nabłonek rowu zostanie wolny od leżącej pod nim tkanki łącznej, umieść go w pustej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml wstępnie pokrytej FBS. Wykonaj przycinanie nabłonka przed lub po odłączeniu nabłonka CVP (ryc. 1C, D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 1: Wypreparowany język i złuszczony nabłonek CVP. (A) Język jest wycinany, a przedni język jest usuwany przez przecięcie tuż przed wyniosłością międzytrzonową (linia przerywana), pozostawiając tylny język, który zawiera CVP (skrzynka) (B) Igła jest wprowadzana tuż przed wzniesieniami międzytrzonowymi (strzałka), a mieszanina enzymów jest wstrz...