$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy
- Znieczulenie myszy
- Przygotować pentobarbital sodu (50 mg/kg) w strzykawce.
- Chwyć mysz (8-tygodniowego samca C57BL/6) lewą ręką tak, aby jej brzuch był skierowany do góry, a głowa niżej niż ogon. Zdezynfekuj skórę brzucha 75% alkoholem.
- Trzymając strzykawkę w prawej ręce, przekłuć białą linię brzucha igłą lekko w prawą stronę skóry na 3–5 mm. Upewnij się, że igła strzykawki i skóra są ustawione pod kątem 45°, powoli wstrzyknij pentobarbital do jamy brzusznej. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.
- Sprawdź, czy znieczulenie powiodło się przez brak odruchu prostującego.
- Wstrzyknąć izotiocyjanian rodaminy B do żyły ogonowej.
- Przygotować 100 μl 10 mg/ml izotiocyjanianu rodaminy B z dekstranem w strzykawce.
- Przetrzyj ogon myszy 75% alkoholem.
- Przytrzymaj ogon lewą ręką, trzymaj strzykawkę w prawej ręce z igłą równolegle do żyły i wstrzyknij 100 μl barwnika.
- Po wstrzyknięciu należy zatamować krwawienie bawełnianym wacikiem.
- Namocz sierść na brzuchu myszy gazą zwilżoną sterylną wodą i ogol brzuch myszy za pomocą brzytwy, wykonując ruchy w kierunku futra. Po goleniu dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny.
- Po przetarciu poduszki grzewczej 75% alkoholem otwórz poduszkę grzewczą i umieść mysz na plecach w poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
2. Mocowanie wątroby myszy za pomocą ramki do obrazowania narządów ciała
UWAGA: Ramka do obrazowania organów komercyjnych nie została jeszcze wydana.
- Umieść czystą przyssawkę w ustalonej pozycji.
- Zainstaluj urządzenie do obrazowania narządów (Rysunek 1) i przetrzyj poduszkę grzewczą i przyssawkę 75% alkoholem.
- Podłącz przyssawkę (o średnicy 5 mm) do węża pompy próżniowej i włącz pompę próżniową.
- Na sterylnym stole wysterylizowanym 75% alkoholem dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, następnie dezynfekuje okolice miejsca nacięcia myszy 3 razy na przemian 75% roztworem alkoholu i chlorheksydyny, a następnie nożyczkami chirurgicznymi odcina 2 cm skóry od dolnej granicy mostka myszy i odsłania wątrobę.
- Umieść mysz razem z poduszką grzewczą na podstawie uchwytu.
- Wyreguluj uchwyt do obrazowania narządów tak, aby przyssawka przytrzymywała wątrobę. Następnie użyj podciśnienia 30–35 kPa do ssania, tak aby wątroba przyczepiła się do przyssawki (ryc. 2).
3. Regulacja wielofotonowego laserowego mikroskopu skaningowego
- Włącz mikroskop wielofotonowy i wybierz obiektyw 60x/1,00 W.
- Zamocuj ramkę i mysz pod soczewką obiektywu.
- Dodaj kroplę zwykłej soli fizjologicznej, która może pokryć całą soczewkę, która jest środkiem przyssawki, i wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby dotykała tylko normalnej soli fizjologicznej.
- Kliknij dwukrotnie ikonę komputera, aby włączyć oprogramowanie lasera i włączyć przełącznik. Następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk zasilania i migawkę przez 3 sekundy.
- Ustaw długość fali na 800 nm.
- Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu za pomocą komputera.
- W polu Acquisition Setting (Ustawienie akwizycji) ustaw Laser 800 (Laser 800).
