$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE
1. Przygotowanie roztworu barwnika błękitu metylenowego
- Odmierz 0,1 g niebieskiego metylenu w proszku.
- Błękit metylenowy rozpuścić całkowicie w 10 ml soli fizjologicznej lub 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez wirowanie.
- Przefiltrować roztwór błękitu metylenowego o stężeniu 10 mg/ml za pomocą filtra strzykawkowego (wielkość porów membrany 0,45 μm), aby wyeliminować zatykanie podczas wstrzykiwania.
- Zbierz sterylny zestaw do żył skóry głowy (27 G x 3/4") z jednorazową strzykawką o pojemności 3 ml i napełnij strzykawkę 3 ml przefiltrowanym roztworem błękitu metylenowego.
nuta: Aby zapobiec ciśnieniu hydrostatycznemu i późniejszemu przepływowi barwnika, umieść końcówkę igły nad strzykawką wypełnioną roztworem błękitu metylenowego.
2. Presekcja embrionów prenatalnych
- Wyczyść nożyczki preparacyjne i kleszcze 70% etanolem.
- Aby pobrać zarodki okołoporodowe w E18.5 lub E19.5, najpierw poddaj eutanazji ciężarne myszy za pomocą inhalacji CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi NIH.
nuta: Ciężarna samica myszy zwykle rodzi od E18,5, jednak większe nerki są łatwiejsze do manipulowania. W związku z tym nerki w wieku E19,5 bliżej urodzenia są łatwiejsze do przeprowadzenia tej analizy. Jednak szczenięta z obustronną niedrożnością dróg moczowych umierają po urodzeniu. W zależności od charakterystyki myszy doświadczalnych, odpowiedni dzień/godzina zbierania powinna być empirycznie określona.
- Rozpyl 70% etanolu na brzuszną powierzchnię brzucha, a następnie otwórz jamę brzuszną brzusznie za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.
- Podnieś całą macicę i oddziel ją od ciała, przecinając nożyczkami preparacyjnymi na końcach rogów macicy.
- Przepłucz całą macicę 1x PBS na szalce Petriego.
- Przeciąć macicę segmentowo nożyczkami preparacyjnymi i usunąć decyduę łożyskową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby odsłonić zarodki w woreczkach żółtkowych.
- Najpierw usuń woreczek żółtkowy, a następnie usuń błonę owodniową za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby uwolnić zarodki okołoporodowe.
- Odetnij głowę zarodkowi nożyczkami do preparowania. Zetrzyj nadmiar krwi sterylnymi gazikami. Przypnij zarodek jego brzuszną powierzchnią do góry na mikroskopie preparacyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową do obrazowania. W razie potrzeby zbierz jego ogon do genotypowania.
nuta: Wykonuj zastrzyki po jednym zarodku na raz.
- Ostrożnie otwórz jamę brzuszną zarodka za pomocą kleszczy, rozrywając skórę. Następnie ostrożnie usuń nadmiar narządów i tkanek, takich jak wątroba, żołądek i jelito, za pomocą kleszczy, przecinając je lub wyciągając, aby odsłonić nerki, moczowody i pęcherz moczowy, które znajdują się grzbietowo (ryc. 1A). W razie potrzeby wchłonąć nadmiar krwi z wypreparowanego zarodka za pomocą sterylnych gazików.
nuta: Nadmiar krwi przeszkadza w identyfikacji miedniczki nerkowej do wstrzyknięcia barwnika.
3. Wstrzykiwanie barwnika błękitu metylenowego do miedniczki nerkowej i monitorowanie przepływu barwnika
- Usunąć pęcherzyki z igły i rurki, usuwając roztwór błękitu metylenowego z końcówki igły za pomocą ciśnienia hydrostatycznego. Podnieś strzykawkę zawierającą roztwór barwnika powyżej poziomu końcówki igły, aby rozpocząć przepływ, a następnie opuść strzykawkę, aby zatrzymać przepływ.
- Wbić igłę do miedniczki nerkowej w pobliżu bliższego moczowodu, uważając, aby nie naruszyć jej po umieszczeniu. Wykonaj wstrzyknięcie barwnika do nerki, aby określić jej niedrożność dróg moczowych.
nuta: Wykonaj wstrzyknięcie barwnika do każdej nieprawidłowej nerki, najpierw postępując w ten sam sposób, aby określić jej niedrożność dróg moczowych.
- Podnieś strzykawkę na około 20 cm, aby zapewnić ciśnienie hydrostatyczne i pozwól przepłynąć 15 μl–60 μl roztworu barwnika. Natężenie przepływu wyniesie około 3 μl/s, jeśli strzykawka zostanie podniesiona do tej wysokości nad zarodkiem.
- Monitoruj niebieski kolor barwnika, zaczynając najpierw w miedniczce nerkowej, następnie na długości moczowodu, a na końcu w świetle pęcherza.
nuta: Potrzeba około 5 sekund, aby zobaczyć słaby kolor barwnika pojawiający się w świetle pęcherza, jeśli moczowód zostanie prawidłowo wprowadzony do pęcherza. Pozwól, aby barwnik zgromadził się w zablokowanym miejscu przez około 15 sekund, jeśli w świetle pęcherza nie pojawi się żaden kolor barwnika.
- Umieścić strzykawkę w dół, aby zatrzymać przepływ barwnika i wyjąć igłę z nerki.
- Wykonaj zdjęcia nerki, moczowodu i pęcherza moczowego prześledzone roztworem barwnika za pomocą aparatu i programu do obrazowania podłączonego do mikroskopu stereoskopowego.
- Zapisz wodonercze nerki, wodonerek i końcowe położenie roztworu barwnika w zeszycie laboratoryjnym.
- Wykonać wstrzyknięcie do przeciwległej nerki zgodnie z opisem w krokach 3.1 do 3.5 i pozwolić barwnikowi przepływać łącznie około 20 s.
nuta: Światło pęcherza moczowego zostanie wypełnione roztworem barwnika, oznaczonym mocnym niebieskim kolorem, jeśli moczowód zostanie prawidłowo wprowadzony do światła pęcherza. Po ocenie niedrożności połączenia dróg moczowych, moczowody i pęcherz moczowy mogą zostać przymocowane do sekcji.
